EBs-DMOG法對人iPSc向血管內皮細胞的分化作用研究.pdf

1、目的：能夠用于細胞治療的血管內皮細胞來源有限。為獲得足夠的內皮細胞，本研究探討一種新的促進人誘導性多能干細胞(Induced pluripotent stem cells，iPSc)向血管內皮細胞分化的方法，即擬胚體（embryoid bodies，EBs）-甲基乙二酰氨基乙酸（Dimethyloxaloylglycine，DMOG）法，獲得足夠的血管內皮細胞為血管內皮細胞移植治療心血管疾病奠定基礎。
　　方法：應用未分化的人iP

2、Sc，先將其形成EBs，然后用如下6種方法進一步誘導促進其向血管內皮細胞分化：A.常氧；B.常氧+血管內皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）（20 mg/ml）；C.常氧+DMOG（0.3mmol/L）；D.缺氧；E.缺氧+VEGF；F.缺氧+DMOG。觀察 iPS-EBs分化的血管內皮細胞形態(tài)結構，并且用逆轉錄PCR（RT-PCR）法及免疫熒光細胞法檢測內皮細胞特異基因（CD31，CD

3、34，VE-cad，KDR，vWF）的表達，以判斷血管內皮細胞分化情況。
　　結果：1.使用孕12天的昆明小鼠制備原代成纖維（Mouse fibroblasts，MEF）細胞，傳代培養(yǎng)到第3代后細胞經絲裂霉素 C去分化處理可以獲得最佳狀態(tài)飼養(yǎng)層細胞。2.狀態(tài)較好的人 iPSc在飼養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)第7天可見克隆生長，第12天可形成供實驗使用的細胞。3.機械法劃取iPSc克隆，在低粘附培養(yǎng)板用EBs培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)制備狀態(tài)較好EBs，經膠

4、原蛋白鋪板后貼壁培養(yǎng)13天可以誘導生成少量血管內皮細胞。4.iPS-EBs在常氧條件下，添加脯氨酸羥化酶抑制劑（DMOG)顯著促進內皮細胞特異基因CD31，CD34，VE-cad，KDR，vWF的表達。在常氧條件下，添加DMOG進行誘導分化，是相對合適的誘導分化條件。能成功表達內皮細胞特異基因CD31，CD34，VE-cad，KDR，vWF。在細胞水平，CD31，CD34為膜表達，KDR、vWF為胞漿表達。其分化形成的內皮細胞數量和質量