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文檔簡介
1、本研究使用測序菌株作陽性對照,藥敏質控菌ATCC25922抽提的DNA作陰性對照,建立了動物源細菌對四環(huán)素類藥物耐藥基因三重PCR檢測方法。同時,針對Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物等組份用量及退火溫度、循環(huán)次數等循環(huán)參數進行優(yōu)化并組裝試劑盒。優(yōu)化結果如下:10×PCRBuffer5μL,濃度為25mM/LMgCl23.0μL,濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物4μL,濃度為2.5U/ULTaq
2、DNA聚合酶0.35μL,濃度掃為25mmol/L三種耐藥基因即tetA基因、tetC基因和tetM基因的特異性上下游引物(25mmol/L)分別1.0μL、0.3μL、0.4μL。將其置于一無菌的PCR反應薄壁管中,加入已制備好的模板5μL,補水至總體積50μL后加入20μL礦物油封頂即可。經過反復實驗對試劑盒的反應條件進行優(yōu)化,最優(yōu)PCR擴增循環(huán)參數為:94℃預變性5min;然后進入循環(huán):94℃變性60s、56℃退火60s、72℃延
3、伸60s,共35個循環(huán),最后72℃延伸10min后,電泳觀察結果。 應用本檢測試劑盒和傳統(tǒng)藥敏試驗方法(K-B法)對100株細菌的耐藥基因型和表型同時進行檢測,并比較兩者檢測過程和檢測結果。結果表明,細菌對四環(huán)素的耐藥率最高為:92%(92/100),對多西環(huán)素的耐藥率次之,為:84%(84/100),對米諾環(huán)素耐藥率相對最低,為:75%(75/100)。在100株待檢細菌中,tetA基因的檢出率為46%(46/100),tet
4、C基因的檢出率為:38%(38/100),tetM基因的檢出率為:33%(33/100)。兩種方法檢出結果的符合率為89%。比較常規(guī)的耐藥基因檢測方法:單重PCR方法與試劑盒采用的三重PCR方法,檢測結果符合率為100%。 在此基礎上,對試劑盒特異性、敏感性、重復性和保質期等進行了系統(tǒng)的檢測試驗。檢測結果表明:本試劑盒具有極強的特異性,只能特異性擴增出目的耐藥基因。本試劑盒具有很高的靈敏度(4.0×104cfu/mL);并且性能
5、穩(wěn)定,顯示出了很好的批內和批間重復性(100%)。試劑盒在-20℃下的保質期為6個月。 利用研制的試劑盒,對我國24個省的樣品進行了耐藥性檢測。結果顯示,不同種屬的動物源細菌、不同來源動物,不同年代大腸桿菌四環(huán)素類藥物耐藥基因分布存在很大的差異。從70年代到今天,不同年代大腸桿菌tet基因的檢出率呈明顯上升的趨勢。 本研究率先在國內外建立了動物源細菌四環(huán)素類藥物耐藥基因三重PCR檢測試劑盒,并進行了初步應用,這在國內外均
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