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文檔簡介
1、目的:本課題旨在構建中國旱獺去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)H1和H2亞基糖基識別域原核表達質粒,在宿主菌內(nèi)誘導表達后得到純化目的蛋白,免疫小鼠,制備多克隆抗體。 方法:應用RT-PCR技術,從中國旱獺肝組織中擴增ASGPRCRDH1和CRDH2cDNA,利用引入的限制性酶切位點體外連接定向克隆到原核表達載體pRSET-B內(nèi),IPTG誘導表達,利用Ni2+親合層析純化目的蛋白,并通過Westernblot方法檢測目的蛋白的抗原性
2、。用純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體,并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、Westernblotting及免疫組織化學(IHC)檢測抗體的靈敏度和特異性 結果:1.通過PCR、酶切和核苷酸測序表明:成功構建了中國旱獺去唾液酸糖蛋白受體H1和H2亞基糖基識別域原核表達質粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2。 2.SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測分析表明,目的蛋白在表達菌
3、BL21(DE3)plysS內(nèi)可以高效表達,觀察到目的蛋白以包涵體的形式存在;并通過Ni2+親合層析獲得了高純度的目的蛋白。 3.利用目的蛋白免疫BALB/c小鼠獲得多克隆抗體,對其進行性質鑒定,證明多.抗具有較好的特異性和較高的效價。 結論:1、成功地構建了原核表達質粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2。 2、獲得的中國旱獺去唾液酸糖蛋白受體H1和H2亞基糖基識別域的多克隆抗體具有特異性較好
4、、效價較高等優(yōu)點.。 本課題的創(chuàng)新點 1.國內(nèi)首次成功構建了表達中國旱獺去唾液酸糖蛋白受體H1和H2亞基糖基識別域的原核表達質粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2。 2.國內(nèi)首次利用變性的ASGPRCRDH1和CRDH2融合蛋白免疫小鼠獲得了兩株特異性好、效價高、敏感性強的多克隆抗體,在肝臟疾病的靶向治療研究中具有潛在的應用價值。 本研究的意義 中國旱獺去唾液酸糖蛋白受體CRD
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