無創(chuàng)肢體缺血預處理延遲相中心肌差異表達蛋白質的分離和鑒定.pdf

1、【目的】
　　采用同位素相對標記與絕對定量（isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）技術來研究無創(chuàng)肢體缺血預處理（Noninvasive Limb Ischemic Preconditioning，NLIP）延遲相階段心肌全部蛋白質表達譜的變化，觀察NLIP延遲相對正常大鼠心肌蛋白質表達的影響，探索NLIP內源性效應的分子機制。
　　【方法】

2、>　　將12只雄性SD大鼠隨機分入預處理組（NLIP組）和對照組（C組），每組6只。NLIP組用橡皮筋環(huán)扎大鼠右后肢根部，阻斷血流5min，開放再灌注5min，共循環(huán)3次，建立NLIP模型； C組大鼠麻醉后不作預處理。于NLIP延遲相即24小時后，分別取兩組大鼠左心室心尖部組織50-100mg，液氮保存。每組6個樣本取等質量混合為一個起始材料進行蛋白抽提。采用iTRAQ技術經蛋白酶解、肽段標記、高PH反向分離、反向液相色譜串聯(lián)質譜分析等

3、步驟檢測NLIP組和C組蛋白表達譜的差異。質譜分析數(shù)據(jù)用Mascot搜索引擎在Uniprot數(shù)據(jù)庫進行肽段和蛋白質的鑒定。用Protein Pilot軟件對報告離子峰強度值進行計算得出蛋白質的定量信息。以組間表達差異Ratio>1.2或Ratio<1/1.2（0.833）且統(tǒng)計學P-Value<0.05為標準篩選差異表達蛋白。利用基因本體論（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫分析差異表達蛋白的生物學功能，用Wolfpsort軟件預

4、測差異表達蛋白的亞細胞結構定位。最后用Western blot驗證部分差異表達蛋白在兩組樣本中的表達水平。
　　【結果】
　　經iTRAQ檢測和數(shù)據(jù)庫搜索，共鑒定得到3280個蛋白質，其中55個蛋白質被認定為顯著差異表達蛋白。NLIP組與C組相比，表達上調的蛋白有35個，表達下調的蛋白有20個。通過對差異表達蛋白的GO注釋及亞細胞結構定位分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要存在細胞質、細胞核及線粒體中，廣泛參與代謝、生物調節(jié)、應激反應及信