吞噬及饑餓誘導巨噬細胞自噬對其吞噬功能的影響.pdf

1、背景:
　　巨噬細胞廣泛存在于機體的各種組織中,主要依靠其吞噬功能清除外源性顆粒、病原體、死亡細胞、凋亡細胞來發(fā)揮維持組織內環(huán)境穩(wěn)定、免疫防御等功能。自噬是細胞清除細胞內物質的一種重要途徑,可以清除錯誤折疊或聚集的蛋白質,受損的細胞器,如線粒體,內質網和過氧化物酶體,以及細胞內的病原體,維持內環(huán)境穩(wěn)定。自噬與吞噬之間存在著密切聯系,而自噬與吞噬之間聯系及其機制目前還不清楚。研究自噬對巨噬細胞吞噬功能的影響對闡明巨噬細胞自噬與吞噬之

2、間的關系、進一步研發(fā)增強巨噬細胞吞噬功能藥物有重要意義。
　　目的:
　　實時動態(tài)觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞的全過程;觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞后的自噬變化,研究饑餓誘導的自噬對巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響,初步探討自噬在巨噬細胞吞噬功能中的作用。
　　方法:
　　1.巨噬細胞的分離與純化
　　實驗前72h給小鼠腹腔注射0.5％淀粉生理鹽水2~3ml,取小鼠腹腔灌洗液,離心后在細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2小時,洗去未貼壁細

3、胞即得到純化小鼠腹腔巨噬細胞。
　　2.實時動態(tài)觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞的過程
　　將收獲的小鼠腹腔巨噬細胞種在激光共聚焦細胞培養(yǎng)皿中,加入雞紅細胞。在活細胞工作站實時動態(tài)觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞的全過程。
　　3. MDC熒光染色及分析
　　單丹磺酰尸胺(MDC)為細胞自噬體特異性標記物。在巨噬細胞吞噬雞紅細胞6 h后加入終濃度為0.05mmol/L的MDC于37℃溫育15min,PBS洗3次,4%多聚甲醛固1

4、5min,PBS洗3次。通過激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細胞內的自噬體并進行統(tǒng)計分析。
　　4. Western Blot分析LC3的表達
　　用饑餓的方法誘導巨噬細胞自噬,裂解細胞提取總蛋白,通過 Western Blot分析LC3的表達。
　　5.巨噬細胞吞噬雞紅細胞的定量分析
　　在12孔板放置經多聚賴氨酸包被的蓋玻片,接種小鼠腹腔巨噬細胞于12孔培養(yǎng)板中,2h后用 PBS洗去未貼壁的細胞并培養(yǎng)過夜。巨噬細胞經

5、 EBSS或EBSS+3-MA處理3h,將雞紅細胞加入培養(yǎng)板中與巨噬細胞共孵育1.5h。吞噬結束后,用PBS清洗以除去未吞噬的雞紅細胞,接著用4%的多聚甲醛固定,進行HE染色,光學顯微鏡下拍照,進行統(tǒng)計分析。
　　6.統(tǒng)計學方法
　　所有試驗分3-5次獨立完成,數據用均數±標準誤表示。組間的差異用單因素的方差分析,而兩組之間的差異用t檢驗,統(tǒng)計在SPSS10.0軟件統(tǒng)計包中進行,P<0.05表示差異有顯著性。
　　結果

6、:
　　1.動態(tài)觀察到巨噬細胞吞噬雞紅細胞的全過程,整個過程可分為識別粘附、內吞、消化三個階段。巨噬細胞首先識別粘附雞紅細胞,而后通過偽足逐漸將雞紅細胞包圍開始內吞過程。整個吞噬過程數歷時數分鐘至數十分鐘不等,一個巨噬細胞可吞噬一個或多個雞紅細胞。
　　2.巨噬細胞吞噬雞紅細胞6h后自噬增強。
　　3. EBSS代替完全培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細胞3h后自噬特異性蛋白 LC3Ⅱ表達明顯增高,這種增高可以被3-MA抑制。