四跨膜蛋白CD151與肝細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移及其對HGF-c-Met信號轉(zhuǎn)導的影響.pdf

1、肝癌是國內(nèi)常見的惡性腫瘤之一,其侵襲轉(zhuǎn)移與復發(fā)是患者死亡的主要原因之一。因此,探索肝癌侵襲轉(zhuǎn)移與復發(fā)的發(fā)生機制,尋求有效的抗肝癌轉(zhuǎn)移與復發(fā)治療措施,對改善肝癌患者的預后具有重要意義。
　　 在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移與復發(fā)中,HGF/c-Met信號系統(tǒng)的“對話”有著重要地位,這一作用在肝癌切除術(shù)后,殘留肝臟再生,致HGF/c-Met系統(tǒng)處于活躍的狀態(tài),從而促進殘留肝癌細胞增殖使其與肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移、復發(fā)的關(guān)系也表現(xiàn)尤為突出。HGF/c-Met信

2、號系統(tǒng)在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移與復發(fā)中的重要地位,也為肝癌侵襲轉(zhuǎn)移與復發(fā)的治療提供了新的靶點。當前,已發(fā)現(xiàn)多種HGF/c-Met信號的抑制劑,但所發(fā)現(xiàn)的HGF/c-Met抑制劑都有不同程度局限,如HGF競爭性拮抗劑NK4,c-Met受體的選擇性抑制劑PHA-665752只能在一定程度上抑制HGF/c-Met信號,究其原因是HGF/c-Met與其它信號間的交互作用,如HGF/c-Met信號與整合素信號間的交互作用。有研究表明四跨膜蛋白CD151可與

3、c-Met形成一功能復合物,并在HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導以及其與其它信號間的交互作用中扮演重要的角色,可能為抑制HGF/c-Met信號的全新靶點。目前,國內(nèi)外還沒有CD151在肝癌中研究的報道,同時,CD151在HGF/c-Met信號中的作用也缺乏系統(tǒng)研究。本實驗首先在肝癌、相應癌旁、正常肝組織以及不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系中檢測CD151表達差異;研究其與肝癌發(fā)生、發(fā)展以及預后的相關(guān)性;通過轉(zhuǎn)染與干擾調(diào)節(jié)CD151表達后,探討CD151

4、與肝癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)系;最后對CD151在HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導中的具體作用進行研究。
　　 第一部分四跨膜蛋白CD151在肝癌中的過表達
　　 目的:檢測肝癌、癌旁和正常肝組織中四跨膜蛋白CD151的mRNA與蛋白表達,分析其與肝癌發(fā)生的關(guān)系。
　　 方法:應用普通RT-PCR,熒光定量PCR與免疫組織化學技術(shù)檢測CD151在肝癌、相應癌旁、正常肝組織中的表達,并比較三組間CD151的表達差異。

5、　　 結(jié)果:CD151在肝癌、相應癌旁和正常肝組織中均有表達,相對表達量分別為3.6±0.9(0.5-8.2),2.7±0.1(0.0-6.5)與1.8±0.8(0.0-3.1),肝癌與相應癌旁組織間差異明顯(P＜0.05),CD151在癌旁與正常肝組織的表達也存在差異(P＜0.05)。免疫組織化學顯示CD151主要分布于細胞膜,其在肝癌組織中的表達明顯高于后兩者(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:四跨膜蛋白CD151在肝癌發(fā)生中

6、可能有重要作用。
　　 第二部分CD151/或c-Met與肝癌臨床病理特征及預后的關(guān)系
　　 目的:研究CD151和c-Met在原發(fā)性肝癌中表達,探討CD151和c-Met與原發(fā)性肝癌的關(guān)系及臨床生物學意義。
　　 方法:應用熒光定量PCR檢測120例肝癌組織中CD151與c-MetmRNA的表達,組織芯片檢測520例肝癌組織中CD151與c-Met蛋白的表達,SSPS11.5統(tǒng)計分析兩者與肝癌臨床病理特征及預后

7、的關(guān)系。
　　 結(jié)果:CD151蛋白的過表達與肝癌患者的無包膜、高分期與分級、腫瘤細胞低分化、有門脈癌栓及多衛(wèi)星灶等臨床病理因素有關(guān)(p＜0.05);而c-Met與有門脈癌栓、腫瘤直徑＞0.5cm、多衛(wèi)星灶、高分期與分級與腫瘤細胞低分化(P＜0.05)等相關(guān)。CD151與c-Met在肝癌中表達呈中度相關(guān),有顯著性意義(r=0.051,p=0.013),CD151+組的3、5、7年生存率明顯低于CD151-組(P＜0.01),CD

8、151+/c-Met+組的3、5、7年生存率明顯低于CD151-/c-Met+及CD151-/c-Met組(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:四跨膜蛋白CD151與原發(fā)性肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預后相關(guān);CD151對c-Met生物學功能可能存在影響。
　　 第三部分CD151表達與肝癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)系
　　 目的:研究四跨膜蛋白CD151與肝細胞癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 方法:熒光定量PCR,west

9、ernblot及流式細胞儀檢測不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞中CD151的表達差異;轉(zhuǎn)染pcDNA3-CD151cDNA與pGPU16/GFP/Neo-CD151,篩選出穩(wěn)定細胞株,經(jīng)westernblot,流式細胞儀驗證CD151表達改變后,明膠酶譜研究基質(zhì)金屬蛋白酶分泌變化;MTT檢測CD151表達改變后,細胞增殖能力變化;transwell研究細胞侵襲能力改變。細胞接種于裸鼠體內(nèi),研究CD151表達改變后,細胞成瘤與肺轉(zhuǎn)移能力的改變。

10、>　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染pcDNA3-CD151cDNA與pGPU6/GFP/Neo-CD151于低轉(zhuǎn)移能力的HepG2與高轉(zhuǎn)移的HCCLM3肝癌細胞,篩選的穩(wěn)定細胞株CD151表達改變明顯;明膠酶譜研究顯示CD151的表達與MMP9的分泌呈正相關(guān),而對MMP2的影響較小。肝癌細胞增殖受CD151表達水平影響較小(p＞0.05);CD151高表達組細胞的移動與侵襲能力明顯增強,肺轉(zhuǎn)移灶明顯增加,且以Ⅲ,Ⅳ期為主。
　　 結(jié)論:四跨膜

11、蛋白CD151與肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移正相關(guān)。
　　 第四部分CD151對HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導的影響
　　 目的:研究CD151與c-Met在肝癌細胞中的關(guān)系及其對HGF/c-Met信號的影響。方法:免疫熒光與激光共聚焦研究兩者在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞中的表達與相對分布;免疫共沉淀研究兩者形成復合物情況。以HGF作用于CD151表達改變前后的細胞,westernblot研究HGF/c-Met下游與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要信號分子

12、Akt、FAK、ERK1/2磷酸化差異,分析其在肝癌細胞中對HGF/c-Met信號的影響。
　　 結(jié)果:CD151與c-Met主要表達于肝癌細胞的細胞膜,分布一致;免疫共沉淀研究顯示兩者形成復合物。在HGF作用后,下游信號分子Akt與FAK在CD151表達不同的細胞,磷酸化差異明顯(p＜0.05),而ERK1/2的磷酸化在兩組間無差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:四跨膜蛋白CD151與c-Met在肝癌細胞中形成復合物,