Ese-3基因表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15增殖的影響.pdf

1、背景：
　　結(jié)腸癌是我國臨床常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高并呈年輕化趨勢。由于結(jié)腸癌患者發(fā)病隱匿，確診時往往已是中晚期，在臨床實踐中很多結(jié)腸癌術(shù)后患者在接受多次放、化療后，出現(xiàn)化療耐藥，從而無法有效控制局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致最終死于本病。越來越多的臨床實踐證實分子靶向藥物在腫瘤治療中的優(yōu)勢，因此，尋找新的治療靶分子、研究靶分子作用機(jī)制等已成為結(jié)腸癌等腫瘤治療取得突破的希望所在。既往研究表明，Ese-3基因與腫瘤的發(fā)生密切相

2、關(guān)，在多種惡性腫瘤中表達(dá)缺失或下調(diào)，提示Ese-3基因很有可能成為腫瘤治療的新靶點。但是國內(nèi)外關(guān)于Ese-3基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用及其機(jī)制研究文獻(xiàn)報道甚少。
　　目的：
　　通過免疫組化等實驗方法檢測Ese-3基因在結(jié)腸及結(jié)腸癌中的表達(dá)差異性情況，通過慢病毒介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) Ese-3基因的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT15-Ese3，觀察該基因?qū)?xì)胞的增殖能力、克隆形成能力以及細(xì)胞周期、凋亡等增殖相關(guān)生物學(xué)特性的影響。

3、以此初步探索Ese-3基因在結(jié)腸癌發(fā)生中的作用和作為潛在治療靶點的可能性。
　　方法
　　運用免疫組織化學(xué)SP法對結(jié)腸癌患者術(shù)后病理標(biāo)本進(jìn)行染色，檢測Ese-3基因在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織及癌旁組織中的表達(dá)差異性情況；在結(jié)腸癌細(xì)胞系及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中，通過Western-Blot、realtime-qPCR方法檢測Ese-3蛋白的表達(dá)情況；采用慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)Ese-3基因的細(xì)胞及相應(yīng)對照細(xì)胞，運用細(xì)胞計數(shù)

4、法、平板克隆形成實驗、流式細(xì)胞儀等方法分別檢測過表達(dá)Ese-3的HCT15細(xì)胞及對照細(xì)胞的增殖速度、克隆形成能力及細(xì)胞周期。
　　結(jié)果：
　?。?）免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：Ese-3蛋白在結(jié)腸癌及癌旁組織之間的表達(dá)具有顯著差異性（P?0.05）。在正常的結(jié)腸癌旁組織中，可見Ese-3呈棕黃色或棕褐色陽性表達(dá)，陽性顆粒主要定位于細(xì)胞核中，而在相應(yīng)的結(jié)腸癌組織中Ese-3多呈陰性表達(dá)。
　?。?） Western-Blo

5、t結(jié)果顯示：Ese-3蛋白在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞（FHC）內(nèi)明確表達(dá)，而在結(jié)腸癌細(xì)胞中未見表達(dá)（HCT116、HCT15、SW480）或低表達(dá)(HCT8、SW620)。
　　（3） qPCR方法檢測結(jié)腸正常上皮FHC中Ese-3擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，分析結(jié)果提示擴(kuò)增曲線為S型，呈明顯的指數(shù)擴(kuò)增期；熔解曲線分析顯示Ese-3為擴(kuò)增產(chǎn)物中唯一的擴(kuò)增子。計算基因表達(dá)量結(jié)果顯示Ese-3在結(jié)腸正常上皮FHC中的表達(dá)豐度為中度。
　　（4）細(xì)

6、胞計數(shù)法繪制細(xì)胞增殖曲線發(fā)現(xiàn)，慢病毒載體LV-Ese-3感染的HCT15細(xì)胞與空載體對照組相比，細(xì)胞數(shù)目顯著減少，說明上調(diào)Ese-3的表達(dá)，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖速度明顯減慢。
　?。?）克隆形成實驗結(jié)果顯示，慢病毒載體LV-Ese-3感染HCT15細(xì)胞后，與陰性對照組相比，細(xì)胞的克隆形成能力顯著下降。
　?。?）流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果表明，慢病毒過表達(dá)Ese-3后，HCT15細(xì)胞G0/G1期百分率增加到62.73％，S期減少到

7、21.72%，與相應(yīng)對照HCT15-NC細(xì)胞G0/G1期48.60%、S期32.67%相比，差異有顯著性（P?0.05）。
　　結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果表明，Ese-3基因在結(jié)腸及結(jié)腸癌中表達(dá)具有差異性，即Ese-3基因在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)或缺失，并通過體外實驗初步證實了Ese-3基因抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15細(xì)胞增殖、降低了細(xì)胞克隆形成能力、抑制細(xì)胞進(jìn)入S期的作用，提示Ese-3作為抑癌基因其表達(dá)的下調(diào)或缺失可能與結(jié)腸癌的發(fā)