VEGF轉染對骨髓間質干細胞及對粥樣硬化動脈TFPI的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化病變中VEGF與TFPI呈同相改變，且密切相關，但其相互作用機制并不清楚。本實驗設想通過調節(jié)VEGF基因觀察TFPI的變化，進一步探討二者的關系，尋找同相調節(jié)二者的方法，達到既穩(wěn)定血管內皮又抑制血栓形成的作用，以達到更有效治療動脈粥樣硬化目的。 骨髓間質干細胞是一種具有高度增殖和分化能力的成體干細胞。近年來發(fā)現骨髓間質干細胞在特定的條件下還可以向血管內皮細胞分化。骨髓間質干細胞不僅具有干細胞的共性，而且具有來源豐富、

2、無免疫排斥、無年齡限制、無倫理學爭議，能夠轉染和長期表達外源性基因。本實驗選擇骨髓間質干細胞為工程細胞。 RNA干擾是目前最有效的基因沉默技術，能特異性抑制靶基因的轉錄，進而下調相應蛋白質水平及功能，它能快速而準確敲除特定基因。許多研究在動物疾病模型或培養(yǎng)細胞中，利用該項技術阻斷相關基因的表達。 本研究通過轉染VEGF和沉默VEGF觀察TFPI變化，初步了解二者的相互關系，探索以骨髓間質干細胞為工具的基因治療，尋找新的有效的動脈

3、粥樣硬化治療方法。 一、載體的構建 目的：構建pcDN-A3.1(-)VEGF真核表達載體；構建針對VEGF的發(fā)卡樣siRNA真核表達載體pU-VEGF-siRNA，為進一步研究其對動脈粥樣硬化的作用奠定基礎。 方法 應用DNA重組方法，將編碼VEGF cDNA定向克隆于真核表達載體pcDNA3.1(-)中，構建pcDNA3.1(-)VEGF真核表達質粒，通過酶切及測序鑒定；合成一對互補并編碼相應短發(fā)夾狀

4、VEGF-siRNA的寡核苷酸鏈，將其插入到pSilencer<'TM>2.1-U<,6> neo載體中，經測序鑒定所構建的重組載體是否正確。 結果 酶切結果與相應的載體和基因相同，對pcDNA3.1(-)VEGF進行測序，結果表明VEGF已正確克隆到pcDNA3.1(-)質粒；測序示pU-VEGF-siRNA序列正確。 結論 pcDNA3.1(-)VEGF、pU-VEGF-siRNA真核表達載體構建成功

5、。 二、VEGF對人骨髓間質干細胞TFPI的影響 目的:建立骨髓間質干細胞分離、培養(yǎng)的方法，觀察其生物學特性，對分離、培養(yǎng)的骨髓間質干細胞進行鑒定；觀察真核表達載體peDNA3.1(-)VEGF、pU-VEGF-siRNA轉染骨髓間質干細胞后VEGF、TFPI mRNA表達的變化及VEGF、TFPI蛋白質水平的變化。 方法 1．抽取幼兒骨髓，Pereoll溶液密度梯度離心法分離后，將細胞重懸在人的骨髓間質

6、干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測其生物學特性及多向分化潛能。 2．脂質體介導pcDNA3.1(-)VEGF質粒轉染體外培養(yǎng)的骨髓間質干細胞，熒光顯微鏡觀察轉染效果，RT-PCR方法檢測轉染后骨髓間質干細胞VEGF、TFPI mRNA表達水平，免疫印跡法半定量檢測轉染后骨髓間質干細胞VEGF、TFPI蛋白質水平，MTT法檢測轉染后骨髓間質干細胞培養(yǎng)上清液VEGF的生物學活性； 3．脂質體介導pU-VEGF-siRNA質粒轉染體外培

7、養(yǎng)的骨髓間質干細胞，熒光顯微鏡觀察轉染效果，RT-PCR方法檢測轉染后骨髓間質干細胞VEGF、TFPI mRNA表達水平，免疫印跡法半定量檢測轉染后骨髓間質干細胞VEGF、TFPI蛋白質水平。 結果 1．骨髓間質干細胞的生物學特性：原代細胞接種后，72小時首次換液，細胞貼壁后胞漿充盈，外觀呈梭形，7天后可見形狀均一的細胞組成的集合，即為骨髓間質干細胞集落。骨髓間質干細胞生長到亞融合狀態(tài)時，進行傳代培養(yǎng)，傳至第5代，骨髓間

8、質干細胞被純化，多次傳代后的細胞呈均勻有序的成纖維樣細胞；不同的換液時間對原代骨髓間質干細胞的生長影響差異無統計學意義；不同代骨髓間質干細胞生長曲線基本相同，3天進入對數生長期，6天達高峰，以后進入平臺期；不同代骨髓間質干細胞貼壁率相似，隨時間推移增高，增高速度先快后慢；骨髓間質干細胞增殖活性在一定的范圍內隨著血清濃度的增加而增大，當血清濃度超過20％時，細胞增殖活性不再增高；骨髓間質干細胞增殖活性在一定種植密度范圍內隨種植細胞數量增加

9、而增高，在種植細胞密度為10×10<'4>/ml時，增殖活性最高； 2．所培養(yǎng)的骨髓間質干細胞在特定的培養(yǎng)條件下具有向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞分化的能力，符合判斷骨髓間質干細胞的金標準。 3．熒光顯微鏡示脂質體介導質粒轉染體外培養(yǎng)的骨髓間質干細胞成功，效率較高；與對照組相比，VEGF、TFPI mRNA表達水平在pcDNA3.1(-)VEGF轉染組顯著增高，pU-VEGF-siRNA轉染組顯著降低，空載體轉染組無明顯

10、變化； 4．與對照組相比，VEGF、TFPI蛋白質水平在pcDNA3.1(-)VEGF轉染組顯著增高，pU-VEGF-siRNA轉染組顯著降低，空載體轉染組無明顯變化；與未轉染質粒組相比，轉染pcDNA3.1(-)VEGF真核表達載體的骨髓間質干細胞培養(yǎng)上清液的內皮細胞組M80處的吸光值明顯增高，轉染空載體質粒、PU-VEGF-siRNA質粒組無變化。 結論 1．所分離、培養(yǎng)的骨髓間質干細胞是純的、可長期傳代、擴

11、增、穩(wěn)定的骨髓間質干細胞。 2．轉染VEGF基因可提高骨髓間質干細胞VEGF、TFPI mRNA表達水平，上調其VEGF、TFPI蛋白質水平； 3．轉染VEGF-siRNA基因可降低骨髓間質干細胞VEGF、TFPImRNA表達水平，下調其VEGF、TFPI蛋白質水平。 4．VEGF基因轉染骨髓間質干細胞后，其培養(yǎng)上清液具有較強的促內皮細胞增生作用。 三、VEGF對SD大鼠主動脈組織TFPI的影響

12、目的:建立SD大鼠動脈粥樣硬化模型；觀察尾靜脈注射轉基因骨髓間質干細胞對SD大鼠主動脈組織VEGF、TFPI mRNA表達的變化及其VEGF、TFPI蛋白質水平的變化。 方法 1．66只雄性SD大鼠隨機分為6組，每組11只，分別為A、B、C、D、E、F組，A組喂養(yǎng)普通飼料， B、C、D、E、F組喂養(yǎng)動脈粥樣硬化飼料。超聲及病理檢查升主動脈、主動脈弓、降主動脈、腹主動脈。 2．SD大鼠造模型成功后，經尾靜脈向大鼠體

13、內注入不同無血清培養(yǎng)基，每只鼠注射1ml，其中含骨髓間質干細胞的培養(yǎng)基中細胞密度為6×10<'7>/ml；A組不含任何成分的無血清培養(yǎng)基，B組不含任何成分的無血清培養(yǎng)基，C組含未經任何干預的骨髓間質干細胞，D組含轉染空載體質粒的骨髓間質干細胞，E組含轉染pcDNA3.1(-)VEGF質粒的骨髓間質干細胞，F組含轉染pU-VEGF-siRNA質粒的骨髓間質干細胞。 3．飼養(yǎng)一周后超聲及病理檢查升主動脈、主動脈弓、降主動脈、腹主動脈

14、，RT-PCR方法檢測主動脈組織VEGF、TFPI mRNA表達水平，免疫印跡法半定量檢測主動脈組織VEGF、TFPI蛋白質水平。 結果 1．對照組SD大鼠主動脈未出現病變，動脈粥樣硬化組大鼠3月后超聲及病理可以檢測到主動脈動脈粥樣硬化斑塊。 2．經尾靜脈注射骨髓間質干細胞后超聲及病理可以檢測到動脈粥樣硬化斑塊較前無明顯變化。 3．與正常鼠相比，主動脈組織VEGF、TFPI mRNA表達水平在注射轉染pc

15、DNA3.1(-)VEGF基因骨髓間質干細胞模型鼠組顯著增高，注射轉染pU-VEGF-siRNA基因骨髓間質干細胞模型鼠組顯著降低，未注射骨髓間質干細胞模型鼠組、注射正常骨髓間質干細胞模型鼠組、注射轉染空載體骨髓間質干細胞模型鼠組無明顯變化。 4．與正常鼠相比，主動脈組織VEGF、TFPI蛋白質水平在注射轉染pcDNA3.1(-)VEGF基因骨髓間質干細胞模型鼠組顯著增高，注射轉染pU-VEGF-siRNA基因骨髓間質干細胞模型

16、鼠組顯著降低，未注射骨髓間質干細胞模型鼠組、注射正常骨髓間質干細胞模型鼠組、注射轉染空載體骨髓間質干細胞模型鼠組無明顯變化。 結論 1．成功建立SD大鼠動脈粥樣硬化模型。 2．骨髓間質干細胞對模型鼠主動脈組織VEGF、TFPI mRNA表達水平，VEGF、TFPI蛋白質水平無影響； 3．轉染VEGF基因的骨髓間質干細胞可提高模型鼠主動脈組織VEGF、TFPI mRNA表達水平，上調其VEGF、TFPI蛋白