食管-賁門癌和配對癌旁組織核黃素轉運基因(C20orf54)全基因外顯子測序.pdf

1、1研究背景與目的：
　　 食管癌與賁門癌具有顯著的流行病學特征與流行地域分布一致,特別是河南、河北和山西三省交界地區(qū),是中國,也是世界上食管癌和賁門癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)。且食管癌與賁門癌有著相似的發(fā)病風險因素,包括營養(yǎng)缺乏、蔬菜水果的低攝入量以及經濟不發(fā)達等。食管癌和賁門癌發(fā)生的分子機制仍不清楚。本課題組通過全基因組關聯分析(Genome-wide Association Study,GWAS)研究,發(fā)現PLCE1和核黃素

2、轉運基因(C20orf54)是食管癌和賁門癌的高易感基因。C20orf54位于常染色體20p13,又稱hRFT2,共有5個外顯子,編碼的蛋白為核黃素轉運蛋白,其生物學特征與rat RFT2有83％的相似性,而此基因的生物學功能尚不十分清楚。C20orf54主要功能是將核黃素由細胞外轉入細胞內。我國老一代科學家早在70年代就已證實核黃素缺乏與食管癌和賁門癌的發(fā)生密切相關,補充核黃素能夠降低發(fā)病風險。核黃素轉運基因變異為食管/賁門癌的預防提

3、供了重要的理論依據。近年來,隨著分子生物學技術的發(fā)展和應用,人們對腫瘤的發(fā)病機制研究早已深入到基因水平,尤其是新興的外顯子測序技術為腫瘤的發(fā)病機制研究提供了非常重要的技術手段。很顯然,進一步了解該基因的變異特征和規(guī)律對闡明食管和賁門癌變分子機制具有重要意義。本課題采用外顯子測序技術和免疫組織化學技術,分析核黃素轉運基因全部外顯子(共5個外顯子)在食管/賁門癌和配對癌旁組織中的變化,初步探討C20orf54外顯子的變異與食管癌和賁門癌發(fā)生

4、的關系。
　　 2研究材料與方法：
　　 2.1研究材料
　　 研究材料為29例食管癌與配對癌旁、肌肉組織,5例賁門癌與配對癌旁組織。大體標本均為手術切除并經病理證實,且癌旁組織均為正常上皮。大體標本分別制備為冰凍組織和石蠟組織。
　　 2.2患者臨床資料收集
　　 研究對象為29例食管癌和5例賁門癌患者,其中男性29例,女性5例,年齡在4l～77歲,平均年齡61.03±8.46歲,分別來自河南省

5、食管/賁門癌高發(fā)區(qū)(11例)和低發(fā)區(qū)(23例),所有患者術前均未進行化療和(或)放療。臨床資料內容包括:個人基本情況,食管癌家族史,詳細臨床資料等。
　　 2.3組織DNA抽提
　　 常規(guī)酚.氯仿抽提法提取冰凍組織DNA。
　　 2.4全基因外顯子測序技術及測序結果分析
　　 本課題采用雙脫氧鏈終止法(Sanger dideoxy mediated chain terminationmethod)對C20

6、orf54全基因外顯子進行檢測。運用Chromas軟件和BLAST,dbSNP及Smart數據庫分析測序結果。
　　 2.5免疫組織化學方法
　　 采用卵白素.生物素.辣根過氧化氫酶復合物(ABC)法。
　　 3結果：
　　 3.129例食管癌和5例賁門癌及配對癌旁、肌肉組織測序結果初步分析。
　　 發(fā)現29例食管癌和5例賁門癌及配對癌旁組織均存在堿基變化較為頻繁的10個變異位點:第3外顯子5個變

7、異位點,第2和第5外顯子分別是2個變異位點,第1外顯子1個變異位點,而第4外顯子上未發(fā)現變異位點。
　　 3.229例食管癌和5例賁門癌與配對癌旁、肌肉組織測序結果比較
　　 比較食管/賁門癌與配對癌旁、肌肉組織測序結果,發(fā)現7種變異類型僅存在于食管/賁門癌組織中,而配對癌旁和肌肉組織中并未發(fā)現。僅比較賁門癌和配對癌旁組織測序結果,發(fā)現7種變異類型僅存在于賁門癌組織中,配對癌旁組織中并未發(fā)現。
　　 3.3食管癌

8、高/低發(fā)區(qū)食管和賁門癌患者癌與配對癌旁、肌肉組織測序結果比較比較來自食管癌高發(fā)區(qū)食管和賁門癌患者癌與配對癌旁、肌肉組織測序結果,分別發(fā)現6種變異類型僅存在于食管和賁門癌組織中,而在低發(fā)區(qū)癌與癌旁組織測序結果無明顯差別。
　　 3.41139T＞C、1139C＞T和1172C＞T三種特殊變異類型
　　 查詢數據庫發(fā)現1139T＞C、1139C＞T和1172C＞T三種變異類型可引起氨基酸的改變(1139:T→Leu[L],C

9、→Pro[P];1172:T→Met[M],C→Thr[T])。
　　 3.5免疫組化結果
　　 分析22例食管癌和4例賁門癌及其配對癌旁組織免疫組化結果,發(fā)現存在變異類型的癌組織,C200rf54的表達多為陽性(87.5%),且存在變異類型的食管癌癌組織,C20ort34的表達均為陽性,存在變異類型的賁門癌癌組織,C20orf54的表達陽性和陰性各占一半,均為胞漿染色。
　　 4結論：
　　 4.1在C

10、20orf54基因外顯子中,發(fā)現10個堿基變化較為頻繁變異位點,提示這10個變異位點可能與食管/賁門癌的發(fā)病風險相關。
　　 4.2 C20orf54基因外顯子主要變異類型同時發(fā)生在食管癌和賁門癌癌組織中,提示這些變異類型可能與食管癌和賁門癌的發(fā)生有關,且提示了食管癌與賁門癌有著相似的發(fā)病風險因素。
　　 4.3高發(fā)區(qū)食管/賁門癌與癌旁組織測序結果有差別,低發(fā)區(qū)無明顯差別。提示C20orf54外顯子的變異可能與環(huán)境相關。