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文檔簡介
1、研究背景:
中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是指由于各種原因造成的腦和脊髓的損傷以及神經(jīng)功能障礙,而神經(jīng)元損傷及功能障礙被認為是最為重要的機制之一。以往研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元損傷的相關機制主要包括谷氨酸興奮性毒性、鈣離子超載、氧化應激和炎癥反應等,其中研究最為深入的是由谷氨酸、谷氨酸受體及鈣離子代謝介導的興奮性神經(jīng)損傷相關機制。但是仍有很多問題沒有解決,如 mGluR5在神經(jīng)元損傷中的作用,以及綜合調控外鈣內流和內鈣釋放對神經(jīng)元損傷的影響等。Hom
2、er1蛋白是一類新型的突觸后致密物質,在神經(jīng)元功能調控中發(fā)揮重要作用。我們以往的研究表明,在創(chuàng)傷性神經(jīng)元損傷后,Homer1a表達明顯增高,可能通過影響I組mGluRs在突觸后膜上的錨定影響神經(jīng)元損傷。然而,Homer1b/c和Homer1a在神經(jīng)元損傷中究竟發(fā)揮什么樣的作用,其具體分子機制如何尚不清楚。
實驗目的:
本研究的目的是:(1)以鈣離子代謝和氧化應激反應為切入點,初步探討谷氨酸所致神經(jīng)元損傷的機制,研究
3、mGluR5在神經(jīng)元損傷中的作用;(2)研究鈣庫調節(jié)鈣離子通道在神經(jīng)元損傷中的作用,探討其阻滯劑神經(jīng)保護作用的可能機制;(3)研究 Homer1b/c在神經(jīng)元損傷中的作用,明確其與內質網(wǎng)應激和線粒體功能障礙的關系;(4)研究Homer1a在神經(jīng)元損傷中的作用,明確其與神經(jīng)元外鈣內流和內鈣釋放調控的關系。
實驗方法
?。?)細胞培養(yǎng):原代小鼠皮層神經(jīng)元離體培養(yǎng);(2)離體神經(jīng)元損傷模型:谷氨酸損傷模型;(3)在體神經(jīng)元損
4、傷模型:小鼠重物下落閉合性腦損傷模型;(4)離體神經(jīng)元損傷評價:細胞活力檢測、LDH釋放檢測、Caspase-3活性檢測和神經(jīng)元凋亡染色;(5)在體神經(jīng)元損傷評價:腦組織含水量檢測、腦組織缺損檢測、神經(jīng)功能學評分和神經(jīng)元凋亡TUNEL染色;(6)基因表達調控:采用慢病毒介導的基因沉默與基因過表達技術上調/下調Homer1b/c和Homer1a的表達;(7)分子表達:分別采用熒光實時定量PCR、Western blot、免疫熒光、免疫組織
5、化學方法檢測各種分子的表達。
實驗結果:
?。?)谷氨酸引起的興奮性神經(jīng)元損傷是一種鈣離子依賴性的氧化應激性損傷;mGluR5激活對谷氨酸引起的興奮性神經(jīng)元損傷具有保護作用;mGluR5通過PKC-ERK信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用;mGluR5在TBI模型中發(fā)揮有限的神經(jīng)保護作用;(2) SKF-96365減輕谷氨酸所致興奮性神經(jīng)元損傷;SKF-96365通過Homer1-Ca2+信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用;(3)下調Ho
6、mer1b/c減輕谷氨酸所致興奮性神經(jīng)元損傷;下調Homer1b/c抑制谷氨酸所致的內質網(wǎng)鈣離子釋放;下調Homer1b/c減輕谷氨酸所致內質網(wǎng)應激;下調Homer1b/c保護谷氨酸損傷后的線粒體功能;(4)過表達Homer1a減輕谷氨酸所致興奮性神經(jīng)元損傷;過表達Homer1a綜合調控外鈣內流與內鈣釋放。
實驗結論:
?。?)谷氨酸所致神經(jīng)元損傷是一種鈣離子依賴性的氧化應激性損傷,激活mGluR5有減輕神經(jīng)元損傷作用
7、。(2)鈣庫調節(jié)鈣通道的非特異性離子通道阻滯劑SKF-96365可通過抑制神經(jīng)元細胞內鈣離子超載,減輕谷氨酸所致神經(jīng)元損傷,其神經(jīng)保護作用的發(fā)揮并不依賴于TRPC離子通道表達的變化,而與對Homer1功能抑制有關。(3)下調 Homer1b/c的表達可以減輕神經(jīng)元損傷,抑制神經(jīng)元凋亡,這種神經(jīng)保護作用與抑制內質網(wǎng)應激和保護線粒體功能有關。(4)過表達Homer1a可通過抑制ROS相關的氧化應激損傷減輕神經(jīng)元凋亡,這種神經(jīng)保護作用與綜合調
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