角膜新生血管相關的長鏈非編碼RNA(lncRNAs)的鑒定及其調控機制研究.pdf

1、目的：正常的角膜組織沒有血管，周圍血管終止于角膜緣，在角膜緣形成血管網，營養(yǎng)成分由此擴散入角膜。無血管化是角膜的主要特征，也是其完全透明，維持正常視力的重要因素。在炎癥、感染、化學傷、變性等疾病中或由于眼科手術，維持角膜無血管的平衡因素被破壞，角膜會發(fā)生病理性新生血管，導致角膜喪失透明，從而最終影響視力，同時角膜新生血管(corneal neovascularization，CN)也是角膜移植手術發(fā)生排斥的高危因素。長鏈非編碼RNA(l

2、ncRNAs)是一類轉錄本長度超過200nt的RNA分子，轉錄水平低于蛋白質編碼基因，具有組織特異性。它們并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上（表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等）調控眾多生物學過程。CN發(fā)病機制復雜，受到各個基因層面的調控，目前對lncRNAs在CN中的研究尚在起步階段，有必要篩選和鑒定與CN有關的lncRNAs，闡明其作用機制，為CN的治療提供新的藥物靶點。本論文旨在建立小鼠的新生血管模型，鑒定小鼠新生血

3、管角膜相關的lncRNAs，并研究其在CN發(fā)生發(fā)展中的潛在的調控機制。
　　方法：建立堿燒傷誘導的小鼠角膜新生血管模型，采用lncRNAs微陣列基因芯片技術分析lncRNAs在正常角膜和新生血管化角膜(CN)組織的表達譜，篩選差異表達的lncRNAs;根據Pearson相關性分析，構建lncRNAs/mRNA共表達網絡;通過基因本體(GO)的富集分析和pathway分析等生物信息學技術，探討lncRNAs/mRNA共表達基因在角膜

4、新生血管發(fā)生的作用機制及可能的病理途經;根據芯片檢測結果，篩選了20個差異表達顯著的lncRNAs，對兩組角膜樣本用RealTime PCR驗證芯片檢測結果，同時檢測了抗血管生成因子（PDGF和endostadin）和促血管生成因子（VEGF及iNOS）的表達，分析這些相關的lncRNAs的表達規(guī)律。分別選取差異表達最顯著的上調、下調lncRNAs作為研究靶點，臨床采集角膜炎、化學傷、外傷患者的角膜樣本，采用RealTime-PCR，對

5、篩選出的角膜新生血管相關的靶點lncRNAs進行表達分析驗證，同時檢測樣本促血管生長因子（VEGF，Ang-2，MMP-9）和抗血管生長因子(PDGF)的表達，并與上述兩條靶點lncRNAs的表達趨勢進行比較，分析這兩條相關lncRNAs的表達規(guī)律。利用人臍靜脈內皮細胞株(HUVEC)，通過設置空白對照組、h2o2組、H2O2+Scr siRNA組和H2O2+NR-033585siRNA組，分別進行Hoechst33342染色、JC-1

6、染色、PI染色和Ki67檢測，判斷在氧化應激狀態(tài)下，人同源lncRNAs NR_033585對(HUVEC)活力、增殖的影響，在分子水平探討其潛在的調控機制。
　　結果：動物模型中，通過lncRNAs基因芯片技術，分析CN組和正常組樣品的lncRNAs表達譜，篩選差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)并且變化倍數在3.0倍以上的lncRNAs，共計154條，其中下調的共60條，上調的共94條。GO分析是根據基因本體論，將基因分成三類:生

7、物學進程類，細胞組分類，分子功能類。實驗發(fā)現，高富集lncRMAs/mRNA共表達基因，在細胞外區(qū)（本體:細胞組分類），DNA結合（本體論:分子功能類），和免疫反應（本體論:生物學進程類）。GO富集分析提示CN的生物學行為發(fā)生在細胞外區(qū)，與DNA結合并發(fā)生免疫反應。KEGG數據庫分析結果顯示lncRNAs潛在的靶基因mRNA可能參與多個信號通路，如癌癥信號通路，MAPK信號通路，鈣信號通路，神經活性的配體受體相互作用，縫隙連接，Toll

8、樣受體信號通路和Wnt信號通路。通路分析表明“癌癥通路”基因富集度最高，提示CN的信號通路與癌癥的信號通路有一定的相似性。對篩選出的20條差異表達顯著的lncRNAs，qRT-PCR驗證其中17條的表達水平與芯片檢測結果相一致，上調的lncRNAs與促血管生長因子(VEGF及iNOS)的表達趨勢一致，下調的lncRNAs與抗血管生長因子(PDGF，endostadin)的表達趨勢一致。臨床采集角膜炎、化學傷、外傷患者角膜樣本，分別選取差

9、異表達最顯著的上調、下調lncRNAs作為研究靶點（上調最顯著:人同源NR033585;下調最顯著:人同源chr8:129102060-129109035A反鏈），對上述臨床采集的角膜樣本進行Real Time-PCR檢測，對篩選出的角膜新生血管相關的靶點lncRNAs進行表達分析驗證，同時檢測樣本促血管生長因子（VEGF，Ang-2，MMP-9）和抗血管生長因子(PDGF)的表達，并與上述兩條靶點lncRNAs的表達趨勢進行比較，分析