Orphan核受體Nur77在腸道炎癥中的功能與機(jī)制研究.pdf

1、盡管對(duì)炎癥性腸病的研究相當(dāng)廣泛，但其病理生理仍然不甚明了。腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中，涉及到許多不同細(xì)胞間的相互作用，如腸上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腸神經(jīng)細(xì)胞、腸粘膜內(nèi)的肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及外周血中的免疫細(xì)胞及炎癥細(xì)胞。外周血白細(xì)胞向腸血管內(nèi)皮聚集與血管內(nèi)皮通透性增加在腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中至關(guān)重要。許多因子參與調(diào)節(jié)腸血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能及其與白細(xì)胞的相互作用。其中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)同時(shí)具有血管內(nèi)皮通透活性。然而我們對(duì)VEGF

2、是如何調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能所知有限。我們課題組通過DNA微點(diǎn)陣對(duì)VEGF下游基因進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)VEGF能高度誘導(dǎo)Orphan核受體家族。 核受體是一些轉(zhuǎn)錄因子，能直接調(diào)控基因表達(dá)來適應(yīng)生長發(fā)育、生理上及環(huán)境中的刺激。因此，它們?cè)谏L發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及疾病中起著重要作用。核受體超家族又可分為以下四類亞家族：核受體-I(過氧化物酶增生物激活受體等)、核受體-II(維甲酸X受體等)、核受體-III(雌激素受體等)以及核受體-IV家族。Orph

3、an核受體Nur77(人：TR3，大鼠：NGFI-B)，Nurr1(人：Not1)與Nor-1(人：MINOR)都屬于核受體-IV家族。在最近的文獻(xiàn)報(bào)道中，這三種Orphan核受體無論其種屬來源統(tǒng)稱為Nur77，Nurr1和Nor1。在核受體超家族中，雌激素受體與過氧化物酶增生物激活受體(PPAR-γ)的功能主要是抑制免疫反應(yīng)和炎癥進(jìn)程。然而，我們對(duì)這種新發(fā)現(xiàn)的Nur77核受體家族的功能所知甚少。 第一部分Nur77在炎癥性腸病

4、患者病變腸段的表達(dá)研究 目的：檢測(cè)Nur77在炎癥性腸病患者病變腸段的表達(dá)情況。 材料與方法：將BethIsraelDeconess醫(yī)學(xué)中心胃腸科所提供的6例CD患者、9例UC患者及4例正常對(duì)照的結(jié)腸組織，采用TRIzol法提取總RNA，再經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量Real-TimePCR，測(cè)定Nur77的mRNA水平。將BethIsraelDeconess醫(yī)學(xué)中心病理科所提供的5例CD患者、5例UC患者及2例正常對(duì)照的結(jié)腸石臘

5、切片，進(jìn)行免疫熒光染色及免疫組織化學(xué)染色，了解Nur77蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果：與正常對(duì)照腸段相比，CD與UC患者結(jié)腸Nur77mRNA水平明顯升高(CD升高10倍，UC升高4倍，P均<0.05)。與正常對(duì)照結(jié)腸相比，急性期CD結(jié)腸微血管密度增加，在血管內(nèi)皮細(xì)胞(CD31表達(dá)陽性)與滲出的白細(xì)胞中，Nur77蛋白表達(dá)水平升高，而在結(jié)腸上皮細(xì)胞中，其表達(dá)十分微弱。 結(jié)論：我們的研究顯示，IBD患者結(jié)腸內(nèi)Nur77表達(dá)水平升

6、高，其表達(dá)主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞與滲出的炎癥細(xì)胞。 第二部分Nur77基因敲除小鼠與內(nèi)皮細(xì)胞特異性Nur77轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的易感性研究 目的：利用Nut77基因敲除小鼠結(jié)腸炎模來研究Nur77在腸道炎癥過程中的功能；利用內(nèi)皮細(xì)胞特異性Nur77轉(zhuǎn)基因小鼠來進(jìn)一步了解血管內(nèi)皮中的Nur77在腸道炎癥過程中的功能。 材料與方法：各實(shí)驗(yàn)組小鼠(C57/BL炎癥組12只，Nur77-/-炎癥組12只，F(xiàn)VB

7、炎癥組12只，內(nèi)皮細(xì)胞特異性Nur77轉(zhuǎn)基因組12只)經(jīng)2.5％DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎(另有C57/BL及FVB對(duì)照小鼠各6只)，比較各組小鼠的疾病活動(dòng)情況(DAI)評(píng)分、組織學(xué)損傷評(píng)分、結(jié)腸重量/長度以及髓過氧化物酶(MPO)活性等炎癥參數(shù)，明確各實(shí)驗(yàn)組小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎的易感程度。此外，我們還檢測(cè)了各組小鼠外周血中及巨噬細(xì)胞所分泌的IL-8、TNF-α及IL-1β三種炎癥細(xì)胞因子水平。 結(jié)果：經(jīng)2.5％DSS致炎7天

8、后，Nur77-/-組小鼠的平均DAI評(píng)分為6.9分，平均組織學(xué)損傷評(píng)分3.0分，平均結(jié)腸重量/長度為4.34mg/mm，平均MPO活性為0.61U/1cm結(jié)腸，均明顯低于C57/BL組(上述參數(shù)分別為10.8分、5.5分、5.19mg/mm及1.35U/1cm結(jié)腸，P均<0.05)；Nur77-/-組小鼠外周血中及巨噬細(xì)胞所分泌的平均IL-8分別為537pg/ml和91pg/ml，明顯低于C57/BL，組的1309pg/ml和954p

9、g/ml(P均<0.05)，但TNF-α與IL-1β水平在兩組間并無顯著差異。內(nèi)皮細(xì)胞特異性Nur77轉(zhuǎn)基因組小鼠的平均DAI評(píng)分為10.4分，平均組織學(xué)損傷評(píng)分為6.3分，平均結(jié)腸重量/長度為6.16mg/mm，平均MPO活性為3.72U/1cm，均明顯高于FVB組(上述參數(shù)分別為7.9分、3.3分4.37mg/mm及1.83U/1cm，P均<0.05)；外周血中及巨噬細(xì)胞所分泌的IL-8、TNF-α和IL-1β三種炎癥細(xì)胞因子水平在

10、Nur77轉(zhuǎn)基因組與FVB組之間均未見顯著差異。 結(jié)論：我們首次發(fā)現(xiàn)Nur77-/-小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎易感性降低，而內(nèi)皮細(xì)胞特異性Nur77轉(zhuǎn)基因小鼠則對(duì)DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎易感性增加，這表明Nur77在DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎中具有明顯的促炎癥功能。Nur77在急性結(jié)腸炎中的功能可能部分是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-8的分泌實(shí)現(xiàn)的。 第三部分Nur77調(diào)節(jié)IL-8表達(dá)與分泌的體外研究 目的：了解Nur77對(duì)

11、IL-8的表達(dá)與分泌的調(diào)節(jié)作用。 材料與方法：制備Nur77質(zhì)粒、IL-8-luc基因及NF-γB-luc基因。將Nur77質(zhì)粒DNA(或作為對(duì)照的lacZ)與IL-8-luc基因或NF-γB-luc基因共同轉(zhuǎn)染到巨噬細(xì)胞、結(jié)腸上皮細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞，檢測(cè)這三種細(xì)胞中IL-8-luc和NF-γB-luc的熒光素酶活性，從而評(píng)估Nur77是否具有IL-8或NF-γB的轉(zhuǎn)錄激活功能。此外，構(gòu)建包含Nur77的逆轉(zhuǎn)錄病毒，用以感染上

12、述三種細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)ELISA檢測(cè)IL-8的分泌水平，從而了解Nur77是否可以促進(jìn)這三種細(xì)胞IL-8的分泌。 結(jié)果：在結(jié)腸上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞中，Nur77誘導(dǎo)的IL-8的相對(duì)表達(dá)高于lacZ誘導(dǎo)的IL-8相對(duì)表達(dá)，但在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，Nur77誘導(dǎo)的IL-8的相對(duì)表達(dá)卻降低；Nur77誘導(dǎo)的NF-γB的相對(duì)表達(dá)則在三種細(xì)胞系中均升高(上述P值均<0.05)。結(jié)腸上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞經(jīng)Nur77刺激后，所分泌的IL-8水

13、平分別為758pg/ml和825pg/ml，明顯高于lacZ空白刺激組(IL-8水平分別為193pg/ml和184pg/ml，P均<0.05)。而血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)Nur77刺激后，所分泌的IL-8水平為339pg/ml，反而明顯低于lacZ空白刺激組(877pg/ml，P<0.05)。 結(jié)論：Nur77可以通過激活巨噬細(xì)胞及結(jié)腸上皮細(xì)胞中IL-8基因的轉(zhuǎn)錄功能從而增加巨噬細(xì)胞與結(jié)腸上皮細(xì)胞分泌的IL-8水平。但在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，N