胰島素樣生長因子-1對背根神經節(jié)神經元谷氨酸損傷的保護作用.pdf

1、胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）被認為是一種在體內有廣泛表達并且作用復雜的多效能神經營養(yǎng)因子，目前已知在離體培養(yǎng)的情況下，IGF-1對周圍神經系統(tǒng)許多神經元具有明顯的營養(yǎng)活性。IGF-1可以抑制多種因素引起的中樞神經系統(tǒng)及周圍神經系統(tǒng)神經元的凋亡。 IGF-1對受刺激或損傷的背根神經節(jié)（dorsalrootganglion，DRG）神經元結構及功能的可塑性具有影響。IG

2、F-1能夠介導DRG神經元的細胞內事件，如神經元突起內線粒體的運輸或聚集以及細胞內鈣離子濃度的變化等。目前IGF-1對谷氨酸（glutamicacid，Glu）損傷的DRG神經元的影響作用尚不清楚。本研究旨在觀察IGF-1對Glu損傷的DRG神經元是否具有保護作用。 Glu是一種興奮性氨基酸遞質，分布于哺乳動物的中樞和外周神經系統(tǒng)。大量Glu釋放可過度激活突觸后膜的Glu受體-N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體，促使Ca2+

3、內流，并激活下游的轉導信號，進而可以導致細胞凋亡。因此，本研究將原代分散培養(yǎng)的胎鼠DRG神經元，用Glu（200μmol/L）造成神經元損傷，觀察應用IGF-1對體外培養(yǎng)神經元損傷的保護作用。全文摘要如下： 本研究將原代分散培養(yǎng)的15d胎鼠DRG神經元，在體外分散培養(yǎng)48h，然后將DRG神經元分為3組：其中一組神經元不施加任何干預因素，繼續(xù)培養(yǎng)，作為正常塒照組；另一組神經元在培養(yǎng)液中加200μmol/L的Glu孵育，造成神經元損

4、傷；第三組在加入200μmol/L的Glu的同時，加入10nmol/L的IGF-1繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，用倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察各組標本在不同時間的生長狀態(tài)。終止培養(yǎng)后，用微管相關蛋白2（microtubule associated protein2，MAP2）和4’，6二脒基-2-苯吲哚（4',6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI）雙染DRG神經元，并鑒定神經元。對各組標本分別進行如下處理：用流式細胞儀檢測

5、細胞的凋亡率；用共聚焦激光掃描顯微鏡檢測各組神經元胞體內鈣離子熒光強度的變化，用Westernblot檢測caspase-3前體蛋白表達的變化。根據以上各項形態(tài)和功能檢測指標綜合分析IGF-1對Glu損傷的DRG神經元的保護作用。 實驗結果如下： （1）MAP2和DAPI熒光雙染：可見MAP2和DAPI標記的細胞，絕大部分細胞為神經元，僅見少數單染的非神經元細胞。 （2）各組DRG神經元倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察結果：正

6、常培養(yǎng)的DRG神經元突起明顯，突起互相交織形成網狀；Glu損傷的DRG神經元簇狀聚集明顯，有的神經元胞體腫脹，神經元突起斷裂或變短甚至消失，甚至有皺縮成圓形的死細胞脫壁；保護組DRG神經元接近于正常對照組細胞。 （3）各組DRG神經元凋亡率檢測結果：Glu損傷組DRG神經元細胞凋亡率與對照組細胞凋亡率相比顯著增高，而IGF-1保護組神經元細胞凋亡率與Glu損傷組相比顯著降低。 （4）各組DRG神經元細胞內鈣離子熒光強度的檢測

7、結果：Glu損傷組細胞內鈣離子熒光強度明顯增強，且胞體著色強烈，IGF-1保護組細胞內鈣離子的熒光強度與損傷組相比明顯減弱，僅見個別著色較強的受損細胞。正常對照組DRG神經元胞體內Fluo-3標記的鈣離子熒光暗淡、均勻；Glu孵育8h的DRG神經元胞體內鈣離子濃度顯著升高，熒光強度明顯增強；應用IGF-1與Glu共同孵育的標本，細胞內鈣離子著色的熒光強度比單純Glu孵育的神經元明顯減弱。定量分析結果表明，Glu損傷組細胞內鈣離子熒光強度

8、較對照組明顯增高，（P<0.001），IGF-1保護組細胞內鈣離子熒光強度較Glu損傷組明顯降低，（P<0.001），IGF-1保護組DRG神經元胞體內鈣離子的熒光強度與正常對照組相比無顯著性差異（P>0.05）。 （5）Westernblot分析caspase-3前體蛋白表達的結果：IGF-1可以抑制Glu誘導的caspase-3前體蛋白的降解。 以上結果提示：IGF-1可阻止由Glu損傷所引起的體外培養(yǎng)的DRG神經元形