裸鼠抗SO-Rb50瘤細胞生長的免疫相關機理研究.pdf

1、立題背景: 視網(wǎng)膜母細胞瘤是嬰幼兒最常見的眼內惡性腫瘤，約占兒童全身惡性腫瘤的4％，90％發(fā)生于3歲以前。據(jù)估計，每年全世界有5000例（其中包括美國250～300例）RB新病例被確診，且近年來有上升趨勢。其惡性程度高，部分病例雙眼發(fā)病，對視力損害極大，并可危及生命。近年來，盡管RB的診斷和治療較以前都有了很大的提高，但其發(fā)生的具體機理仍不明確，難以達到根治的目的。為了解決這些問題，研究者進行了大量的研究。與RB相關的許多動物模

2、型主要是通過異種移植和轉基因兩種方式在前房、視網(wǎng)膜下或皮下接種瘤細胞實現(xiàn)的，這些動物模型的建立為探討RB發(fā)生機理和治療方法提供了良好的工具，然而這些腫瘤模型卻面臨著成瘤率低的困擾，其原因尚不清楚。因此，探討裸鼠腫瘤模型成瘤率低的原因，并進一步闡明裸鼠對抗腫瘤生長的相關機理，具有重要意義。 腫瘤細胞能否在體內生長與機體的免疫狀態(tài)密切相關。目前，腫瘤免疫已成為腫瘤研究領域的熱點問題之一。機體免疫系統(tǒng)識別腫瘤細胞表面的腫瘤抗原產生免疫

3、應答，引起效應細胞的激活和釋放一系列效應分子，攻擊和清除腫瘤細胞，抑制腫瘤的生長，同時也可能造成自身機體組織的損傷。這一應答能否有效地產生，取決于腫瘤細胞抗原性的強弱和宿主的免疫功能，其中細胞免疫在機體與腫瘤細胞的相互作用中發(fā)揮主導作用。在免疫功能正常的機體中，T淋巴細胞通過特異性識別腫瘤細胞，激活相關細胞因子，發(fā)揮特異性殺傷作用，這一經典的免疫過程已被人們所共識。然而目前眾多的腫瘤動物模型中使用的是裸小鼠，此鼠由于染色體等位基因發(fā)生突

4、變引起先天性胸腺發(fā)育不足，體內缺乏成熟的T細胞，細胞免疫相對低下，推測特異性細胞免疫在裸鼠對抗腫瘤生長中不是決定性力量。但其內的前T細胞及非特異性免疫細胞正常，可能在排斥瘤細胞過程中發(fā)揮一定作用。近年來，機體的非特異性免疫細胞，特別是中性粒細胞、NK細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，在抗腫瘤中的作用及機制日益受到研究者的重視。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，NK細胞既可以通過“內識別”方式直接與腫瘤細胞發(fā)生作用，也可以在中性粒細胞、單核細胞或巨噬細

5、胞的作用下被激活而發(fā)生抗腫瘤的作用，但相關的具體機制到目前為止仍然不清楚。闡明非特異性免疫細胞等在機體抗腫瘤中的作用，為進一步研究腫瘤發(fā)生機理和免疫治療提供依據(jù)，是當前腫瘤免疫學研究領域迫切需要解決的問題。 研究目的: 觀察SO—Rb50瘤細胞在裸小鼠體內早期分布和成瘤情況，并探討裸小鼠對抗SO—Rb50瘤細胞生長的免疫學機制。 方法: 1.裸小鼠22只，經尾靜脈接種SO—Rb50瘤細胞，其中4只裸小鼠接

6、種的SO—Rb50瘤細胞經Dil染色標記，運用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測檢Dil標記的SO—Rb50瘤細胞在體內主要臟器的早期分布及含量。2只接種瘤細胞裸小鼠于第7天被處死，HE形態(tài)學觀察各臟器有無病變形成。定期觀察其余裸小鼠的健康狀況及有無腫瘤形成，待其死亡時立即解剖，大體觀察各器官組織有無腫瘤形成，并取肝、脾、腎、肺、眼球和腦等臟器分別行形態(tài)學觀察，免疫組織化學法檢測MPO，CD56，CD68，CD3，CD20和CD79的表達?？瞻?/p>

7、對照裸小鼠4只，經尾靜脈注射無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）0.1ml。 2.裸鼠10只經尾靜脈接種SO—Rb50瘤細胞，在不同時間點處死，運用流式細胞儀檢測CD4+T細胞，CD8+T細胞及NK細胞在不同臟器的含量。設空白對照裸小鼠2只。 結果: 1.裸鼠經尾靜脈接種瘤細胞后，Dil標記的SO—Rb50細胞早期主要分布在肝；脾、肺和外周血中也有少許發(fā)現(xiàn)。術后第二天對各臟器行熒光顯微鏡檢測，觀察到肝臟平均每個視野（100

8、×）Dil標記的SO—Rb50細胞數(shù)為124±44.7，明顯高于脾27.5±12.92和肺3.75±1.5（P<0.05）；術后第二天流式細胞術檢測顯示Dil標記的SO—Rb50瘤細胞分布于肝、脾、肺和外周血，所占比例分別為12.44％、3.49％、0.26％和1.67％。 2.在接種瘤細胞后第7天處死的裸小鼠，肉眼見肝臟表面散在灰白色瘤細胞灶，常規(guī)蘇木素—伊紅染色（HE）染色見肝臟SO—Rb50瘤細胞成團分布，周圍少許中性粒細

9、胞浸潤，其它臟器未見明顯改變；空白對照裸小鼠未見明顯改變。其他16只接種瘤細胞的裸小鼠先后出現(xiàn)體重顯著下降，活動能力極差，僅1只發(fā)生皮下腫瘤，于72d死亡，HE切片及免疫組化證實為RB；15只于28d，30d，38d，44d，50d，54d和62d時相續(xù)死亡，臟器損傷均發(fā)生在肝臟，且改變基本一致。大體觀察見肝臟色暗紅，質地較硬，表面粗糙凹凸不平；HE切片見肝內大量中性粒細胞及部分淋巴細胞浸潤，肝細胞水腫變性，部分壞死；免疫組織化學示MP

10、O，CD56，CD68，CD3，CD20和CD79均有不同程度陽性表達，平均每個視野中性粒細胞所占比例為41.13％±4.10％，明顯高于T細胞、B細胞、巨噬細胞和NK細胞（P<0.001）；另外，NK細胞每個視野所占比例為23.62％±2.82％，明顯高于T細胞、B細胞和巨細胞（P<0.001）；而T細胞和B細胞每個視野分別為12.69％±2.68％、12.61％±2.99％（CD20）和14.70％±1.86％（CD79），兩者之間

11、無統(tǒng)計學差異，但均高于巨噬細胞的比例6.71％±1.25％（P<0.05）。 3.流式細胞術檢測顯示，接種SO—Rb50瘤細胞后裸小鼠NK細胞在肝臟內的含量顯著高于其他臟器；肝臟和脾臟中NK細胞和CD8+T細胞以及外周血的NK細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞隨時間的增加呈升高趨勢。 結論: 將SO—Rb50瘤細胞注入裸小鼠尾靜脈后，瘤細胞主要分布于肝臟，能誘導裸小鼠肝臟發(fā)生對瘤細胞排斥反應，以中性粒細胞和NK