依托泊胺類化合物抗腫瘤多藥耐藥的作用與機制研究.pdf

1、目的：評價新型新型依托泊胺類化合物的體內體外抗腫瘤活性及抗腫瘤多藥耐藥作用，對活性高、毒性小的化合物開展抗腫瘤作用機制的深入研究。
　　 方法：
　　 采用分子對接模擬VP-16及化合物5a-5n(共14個化合物)與拓撲異構酶II(Topn)-DNA復合物的結合能力；MTT法評價化合物5a-5n體外抑制K562、A549以及U251人腫瘤細胞增殖作用，計算IC50值；Topo II介導的DNA剪切-重連接復合物穩(wěn)定性實驗

2、測定5k-5n(5k，51，5m，5n)對Topo II活性的影響；實時熒光定量PCR法及western blot法驗證HL60R及KBR細胞中MDR1基因轉錄水平及p-gp蛋白的表達水平；MTT法評價化合物5k-5n及VP-16的體外抗腫瘤多藥耐藥活性；鼠源性肉瘤S180小鼠移植瘤模型評價5k的體內抑瘤活性；人口腔上皮癌KB及耐藥株KBNCR裸小鼠移植瘤模型評價5k的體內抗腫瘤多藥耐藥活性；P-gp ATP酶活性檢測p-gp底物；采用

3、PI結合流式細胞術檢測細胞周期變化；免疫熒光觀察Cyclin B1蛋白在細胞核內外分布；PI及Annexin-V染色結合流式細胞術檢測細胞凋亡；Western blot法檢測各周期或凋亡相關蛋白含量及活性；Carboxy-DCFDA染色結合流式細胞術檢測活性氧族(reactive oxygen species，ROS)含量變化；JC1染色結合流式細胞術檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，△

4、ψm)變化；LC-MS/MS測定5k體內血藥濃度。
　　 結果：
　　 1、5k-5n對K562、A549和U251人腫瘤細胞均有較好的抑制生長作用，IC50值均<15.0μM，明顯低于VP-16在該腫瘤細胞株上的IC50；
　　 2、5k-5n能穩(wěn)定DNA與Topo II形成的共價復合體從而抑制Topo II活性，對TopoII的抑制活性高于相同劑量的VP-16；
　　 3、5k-5n對藥物敏感的白血病

5、細胞株(HL60，KB)及相應的高表達p-gp耐藥白血病細胞株(HL60R、KB/VCR)均有較好的抑制作用，IC50值均小于2.0μM，其耐藥倍數(RF值)分別為2.7、2.2；而VP-16在HL60R及KB/VCR上的IC50值分別為36.5μM、158.8μM，RF值分別為13.4及11.3；
　　 4、5k-5n對KBR細胞株MDR1基因mRNA的表達水平及p-gp蛋白表達水平均無顯著影響，即5k-5n不能通過直接作用于

6、p-gp蛋白產生抗腫瘤細胞多藥耐藥作用；
　　 5、Pgp-Glo assay system試劑盒檢測p-gp ATP酶活性顯示5k并非p-gp的完美底物，這可能是Sk抗多藥耐藥的重要因素；
　　 6、在荷S-180鼠肉瘤細胞的小鼠實驗中，5k10 mg/kg.5mg/kg、2.5mg/kg以及陽性對照VP-1610mg/kg組的抑瘤率分別為85.5％、36.7％、39.6％和62.4％，5k高濃度組抑瘤率明顯優(yōu)于陽性對

7、照VP-16組；
　　 7、裸小鼠KB及KB/VCR人口腔上皮癌細胞移植瘤實驗結果顯示，在KB移植瘤模型上5k(2.5mg/kg)組及VP-16(5 mg/kg)組均表現(xiàn)出較好的抗腫瘤作用，其T/C％值分別為53％和59％，抑制率分別為59.2％(P<0.01)和60.2％(P<0.01)；在多藥耐藥株KB/VCR移植瘤模型上，5k(2.5 mg/kg)組表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性，其T/C％值為45％，而VP-16組的T/C％值為

8、72％，5k在多藥耐藥腫瘤KB/VCR模型上的抑瘤率比VP-16(5 mg/kg)組高2.4倍；8、20μM的5k作用KB細胞2h能誘導γ-H2AX磷酸化水平的高表達，與之相比，相同濃度的VP-16誘導γ-H2AX蛋白表達效果不明顯，說明5k誘導腫瘤細胞的DNA損傷較VP-16更高效；
　　 9、低濃度的5k能誘導KB細胞周期阻滯于G2/M期。5k表現(xiàn)出比VP-16更強的誘導KB細胞周期阻滯能力，80.0 nM5k作用24小時能

9、使91.7±5.1％KB細胞周期阻滯于G2/M期，而160.0 nM VP-16同樣作用僅能使58.3％的KB細胞阻滯于G2/M期，且5k誘導的KB細胞周期阻滯呈時間與劑量依賴性關系；
　　 10、免疫熒光實驗結果顯示，在Sk誘導G2/M期阻滯的KB細胞中，Cyclin B1蛋白表達顯著上調，并且此時的Cyclin B1蛋白主要集中分布在細胞質中，由此推斷，5k誘導的KB細胞周期阻滯于G2期而非M期；
　　 11、wes

10、tern blot結果顯示，20.0、40.0、80.0 nM Sk作用KB細胞24 h使細胞內cyclinB1水平隨5k劑量的升高而顯著上調，而在Cdc2蛋白水平變化不明顯的同時其磷酸化水平(Thr161位點)隨5k作用劑量的上升而下調.此外，在5k的作用下能誘導Cdc25C(Ser218)、Chkl(Ser317)、Chk2(Thr68)的磷酸化水平上調，但是，觀察到Chkl蛋白略有下調，而Ch2蛋白基本不變。此外，20.0 nM-

11、80.0 nM5k作用KB細胞24小時后，P53以及p-P53(Ser20)蛋白表達水平略有上調，其下游蛋白P21表達上調也不明顯.說明5k可通過影響KB細胞中周期調節(jié)蛋白，誘導KB細胞阻滯于G2期；
　　 12、2 mM的咖啡因預作用30min能逆轉5k對KB細胞的周期阻滯作用，提示我們ATM/ATR激酶與5k誘導的DNA損傷相關。同時，與逆轉周期阻滯作用一致，咖啡因預作用同樣能逆轉由5k誘導的Cdc2 Thr161位點磷酸化

12、的下調、Chk1Ser317位點磷酸化及Chk2 Thr68位點磷酸化的上調，阻止Cyclin B1蛋白的累積；
　　 13、Annexin V/PI雙染結合流失細胞術，定量檢測凋亡結果顯示，1.25μM、2.5μM和5μM5k作用KB細胞48h分別能夠誘導KB細胞發(fā)生凋亡，凋亡率分別為34.56％、48.00％、59.80％(空白對照為8.54％)，呈劑量依賴性關系；
　　 14、western blot結果顯示，相對

13、應的1.25μM、2.5μM和5μM5k作用KB細胞48h可使細胞內procaspase3、procaspase9的表達下調，并檢測到小分子量的裂解片斷(cleaved procaspase3和cleaved procaspase9)；與此同時也觀察到被水解的caspase-3的底物PARP，而抑凋亡蛋白XIAP在5k作用后下調，且Sk的以上作用均優(yōu)于同劑量的VP-16，說明5k誘導細胞凋亡過程中激活了caspase級聯(lián)，5k誘導的細胞

14、凋亡是caspase依賴性的；
　　 15、JC-1染色結合流式細胞術測定細胞線粒體膜電位變化顯示2.5μM Sk作用KB細胞48 h可使71.6％KB細胞呈現(xiàn)綠色熒光(即△ψm降低)，并且呈時間依賴性關系；
　　 16、Carboxy-DCFDA染色并結合流式細胞術檢測細胞內ROS的含量顯示2.5μM5k作用KB細胞0h、1 h、2h、3h后細胞綠色熒光強度隨時間延長而上升，在3h達到最大值為陰性對照的3.5倍，隨后開

15、始下降。然而，用PI結合流式術檢測其凋亡率后發(fā)現(xiàn)，2.5μM Sk作用于KB細胞48 h，能使73.5±7.5％的細胞發(fā)生凋亡或壞死，而500.0μM NAC(ROS抑制劑)預作用3h后再加入5k同樣能使79.9±6.3％的細胞發(fā)生凋亡或者壞死，提示抑制5k誘導的ROS升高并不能抑制5k誘導的凋亡；
　　 17、Wentern blot法檢測蛋白表達水平顯示，1.25μM、2.5μM、5.0μM5k以及5.0μM分別作用于KB細

16、胞48 h后，Bax蛋白表達水平略有上調，Bcl-2略有下調，因此Bax/Bcl-2的比例總體呈上升的趨勢；此外，2.5μM Sk作用于KB細胞6、12、24以及48 h后，分別提取線粒體蛋白及胞漿蛋白，檢測各部分Bax及Bcl-2蛋白的表達。結果顯示，胞漿中的Bax蛋白表達改變不明顯，然而與線粒體膜電位的變化一致，線粒體內的Bax蛋白表達在5k作用48 h時上調明顯，意味著在5k的作用下能促進Bax蛋白進入線粒體，促使PT孔的開放，而

17、這也與線粒體膜電位的改變密切相關。
　　 18、采用LC-MS/MS法檢測5k的血藥濃度結果顯示，單次給予KB細胞移植瘤裸小鼠5k2.5 mg/kg10 min后其體內血藥濃度達到1.67±0.19 pM，而經24 h代謝后，體內Sk血藥濃度降至低于0.034μM，由此可推測5k在體內表現(xiàn)的抗腫瘤作用中誘導腫瘤細胞周期阻滯及誘導腫瘤細胞凋亡兩種作用機制并存。
　　 結論：5k在體內和體外均有較好的抗腫瘤以及抗腫瘤多藥耐藥