依托泊胺類化合物抗腫瘤多藥耐藥的作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的：評價新型新型依托泊胺類化合物的體內(nèi)體外抗腫瘤活性及抗腫瘤多藥耐藥作用，對活性高、毒性小的化合物開展抗腫瘤作用機(jī)制的深入研究。
　　 方法：
　　 采用分子對接模擬VP-16及化合物5a-5n(共14個化合物)與拓?fù)洚悩?gòu)酶II(Topn)-DNA復(fù)合物的結(jié)合能力；MTT法評價化合物5a-5n體外抑制K562、A549以及U251人腫瘤細(xì)胞增殖作用，計(jì)算IC50值；Topo II介導(dǎo)的DNA剪切-重連接復(fù)合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2、測定5k-5n(5k，51，5m，5n)對Topo II活性的影響；實(shí)時熒光定量PCR法及western blot法驗(yàn)證HL60R及KBR細(xì)胞中MDR1基因轉(zhuǎn)錄水平及p-gp蛋白的表達(dá)水平；MTT法評價化合物5k-5n及VP-16的體外抗腫瘤多藥耐藥活性；鼠源性肉瘤S180小鼠移植瘤模型評價5k的體內(nèi)抑瘤活性；人口腔上皮癌KB及耐藥株KBNCR裸小鼠移植瘤模型評價5k的體內(nèi)抗腫瘤多藥耐藥活性；P-gp ATP酶活性檢測p-gp底物；采用

3、PI結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化；免疫熒光觀察Cyclin B1蛋白在細(xì)胞核內(nèi)外分布；PI及Annexin-V染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；Western blot法檢測各周期或凋亡相關(guān)蛋白含量及活性；Carboxy-DCFDA染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測活性氧族(reactive oxygen species，ROS)含量變化；JC1染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，△

4、ψm)變化；LC-MS/MS測定5k體內(nèi)血藥濃度。
　　 結(jié)果：
　　 1、5k-5n對K562、A549和U251人腫瘤細(xì)胞均有較好的抑制生長作用，IC50值均<15.0μM，明顯低于VP-16在該腫瘤細(xì)胞株上的IC50；
　　 2、5k-5n能穩(wěn)定DNA與Topo II形成的共價復(fù)合體從而抑制Topo II活性，對TopoII的抑制活性高于相同劑量的VP-16；
　　 3、5k-5n對藥物敏感的白血病

5、細(xì)胞株(HL60，KB)及相應(yīng)的高表達(dá)p-gp耐藥白血病細(xì)胞株(HL60R、KB/VCR)均有較好的抑制作用，IC50值均小于2.0μM，其耐藥倍數(shù)(RF值)分別為2.7、2.2；而VP-16在HL60R及KB/VCR上的IC50值分別為36.5μM、158.8μM，RF值分別為13.4及11.3；
　　 4、5k-5n對KBR細(xì)胞株MDR1基因mRNA的表達(dá)水平及p-gp蛋白表達(dá)水平均無顯著影響，即5k-5n不能通過直接作用于

6、p-gp蛋白產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用；
　　 5、Pgp-Glo assay system試劑盒檢測p-gp ATP酶活性顯示5k并非p-gp的完美底物，這可能是Sk抗多藥耐藥的重要因素；
　　 6、在荷S-180鼠肉瘤細(xì)胞的小鼠實(shí)驗(yàn)中，5k10 mg/kg.5mg/kg、2.5mg/kg以及陽性對照VP-1610mg/kg組的抑瘤率分別為85.5％、36.7％、39.6％和62.4％，5k高濃度組抑瘤率明顯優(yōu)于陽性對

7、照VP-16組；
　　 7、裸小鼠KB及KB/VCR人口腔上皮癌細(xì)胞移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在KB移植瘤模型上5k(2.5mg/kg)組及VP-16(5 mg/kg)組均表現(xiàn)出較好的抗腫瘤作用，其T/C％值分別為53％和59％，抑制率分別為59.2％(P<0.01)和60.2％(P<0.01)；在多藥耐藥株KB/VCR移植瘤模型上，5k(2.5 mg/kg)組表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性，其T/C％值為45％，而VP-16組的T/C％值為

8、72％，5k在多藥耐藥腫瘤KB/VCR模型上的抑瘤率比VP-16(5 mg/kg)組高2.4倍；8、20μM的5k作用KB細(xì)胞2h能誘導(dǎo)γ-H2AX磷酸化水平的高表達(dá)，與之相比，相同濃度的VP-16誘導(dǎo)γ-H2AX蛋白表達(dá)效果不明顯，說明5k誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷較VP-16更高效；
　　 9、低濃度的5k能誘導(dǎo)KB細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。5k表現(xiàn)出比VP-16更強(qiáng)的誘導(dǎo)KB細(xì)胞周期阻滯能力，80.0 nM5k作用24小時能

9、使91.7±5.1％KB細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，而160.0 nM VP-16同樣作用僅能使58.3％的KB細(xì)胞阻滯于G2/M期，且5k誘導(dǎo)的KB細(xì)胞周期阻滯呈時間與劑量依賴性關(guān)系；
　　 10、免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Sk誘導(dǎo)G2/M期阻滯的KB細(xì)胞中，Cyclin B1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，并且此時的Cyclin B1蛋白主要集中分布在細(xì)胞質(zhì)中，由此推斷，5k誘導(dǎo)的KB細(xì)胞周期阻滯于G2期而非M期；
　　 11、wes

10、tern blot結(jié)果顯示，20.0、40.0、80.0 nM Sk作用KB細(xì)胞24 h使細(xì)胞內(nèi)cyclinB1水平隨5k劑量的升高而顯著上調(diào)，而在Cdc2蛋白水平變化不明顯的同時其磷酸化水平(Thr161位點(diǎn))隨5k作用劑量的上升而下調(diào).此外，在5k的作用下能誘導(dǎo)Cdc25C(Ser218)、Chkl(Ser317)、Chk2(Thr68)的磷酸化水平上調(diào)，但是，觀察到Chkl蛋白略有下調(diào)，而Ch2蛋白基本不變。此外，20.0 nM-

11、80.0 nM5k作用KB細(xì)胞24小時后，P53以及p-P53(Ser20)蛋白表達(dá)水平略有上調(diào)，其下游蛋白P21表達(dá)上調(diào)也不明顯.說明5k可通過影響KB細(xì)胞中周期調(diào)節(jié)蛋白，誘導(dǎo)KB細(xì)胞阻滯于G2期；
　　 12、2 mM的咖啡因預(yù)作用30min能逆轉(zhuǎn)5k對KB細(xì)胞的周期阻滯作用，提示我們ATM/ATR激酶與5k誘導(dǎo)的DNA損傷相關(guān)。同時，與逆轉(zhuǎn)周期阻滯作用一致，咖啡因預(yù)作用同樣能逆轉(zhuǎn)由5k誘導(dǎo)的Cdc2 Thr161位點(diǎn)磷酸化

12、的下調(diào)、Chk1Ser317位點(diǎn)磷酸化及Chk2 Thr68位點(diǎn)磷酸化的上調(diào)，阻止Cyclin B1蛋白的累積；
　　 13、Annexin V/PI雙染結(jié)合流失細(xì)胞術(shù)，定量檢測凋亡結(jié)果顯示，1.25μM、2.5μM和5μM5k作用KB細(xì)胞48h分別能夠誘導(dǎo)KB細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡率分別為34.56％、48.00％、59.80％(空白對照為8.54％)，呈劑量依賴性關(guān)系；
　　 14、western blot結(jié)果顯示，相對

13、應(yīng)的1.25μM、2.5μM和5μM5k作用KB細(xì)胞48h可使細(xì)胞內(nèi)procaspase3、procaspase9的表達(dá)下調(diào)，并檢測到小分子量的裂解片斷(cleaved procaspase3和cleaved procaspase9)；與此同時也觀察到被水解的caspase-3的底物PARP，而抑凋亡蛋白XIAP在5k作用后下調(diào)，且Sk的以上作用均優(yōu)于同劑量的VP-16，說明5k誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中激活了caspase級聯(lián)，5k誘導(dǎo)的細(xì)胞

14、凋亡是caspase依賴性的；
　　 15、JC-1染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞線粒體膜電位變化顯示2.5μM Sk作用KB細(xì)胞48 h可使71.6％KB細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光(即△ψm降低)，并且呈時間依賴性關(guān)系；
　　 16、Carboxy-DCFDA染色并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的含量顯示2.5μM5k作用KB細(xì)胞0h、1 h、2h、3h后細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度隨時間延長而上升，在3h達(dá)到最大值為陰性對照的3.5倍，隨后開

15、始下降。然而，用PI結(jié)合流式術(shù)檢測其凋亡率后發(fā)現(xiàn)，2.5μM Sk作用于KB細(xì)胞48 h，能使73.5±7.5％的細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，而500.0μM NAC(ROS抑制劑)預(yù)作用3h后再加入5k同樣能使79.9±6.3％的細(xì)胞發(fā)生凋亡或者壞死，提示抑制5k誘導(dǎo)的ROS升高并不能抑制5k誘導(dǎo)的凋亡；
　　 17、Wentern blot法檢測蛋白表達(dá)水平顯示，1.25μM、2.5μM、5.0μM5k以及5.0μM分別作用于KB細(xì)

16、胞48 h后，Bax蛋白表達(dá)水平略有上調(diào)，Bcl-2略有下調(diào)，因此Bax/Bcl-2的比例總體呈上升的趨勢；此外，2.5μM Sk作用于KB細(xì)胞6、12、24以及48 h后，分別提取線粒體蛋白及胞漿蛋白，檢測各部分Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，胞漿中的Bax蛋白表達(dá)改變不明顯，然而與線粒體膜電位的變化一致，線粒體內(nèi)的Bax蛋白表達(dá)在5k作用48 h時上調(diào)明顯，意味著在5k的作用下能促進(jìn)Bax蛋白進(jìn)入線粒體，促使PT孔的開放，而

17、這也與線粒體膜電位的改變密切相關(guān)。
　　 18、采用LC-MS/MS法檢測5k的血藥濃度結(jié)果顯示，單次給予KB細(xì)胞移植瘤裸小鼠5k2.5 mg/kg10 min后其體內(nèi)血藥濃度達(dá)到1.67±0.19 pM，而經(jīng)24 h代謝后，體內(nèi)Sk血藥濃度降至低于0.034μM，由此可推測5k在體內(nèi)表現(xiàn)的抗腫瘤作用中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡兩種作用機(jī)制并存。
　　 結(jié)論：5k在體內(nèi)和體外均有較好的抗腫瘤以及抗腫瘤多藥耐藥