Cyr61在肝臟祖細胞增殖中的作用及其與肝癌關系的研究.pdf

1、目的：
　　 在正常的肝臟，肝臟祖細胞(hepatic progenitor cells，HPCs)/卵圓細胞(hepatic ovalcells，HOC)處于休眠狀態(tài)，然而當肝細胞的增殖受到損傷時(如慢性的肝臟疾病)，HPCs/HOC被活化，代替肝細胞介導病理性的肝再生過程，越來越多的研究已經(jīng)證明HPCs/HOC在HCC的形成中發(fā)揮重要的作用，在許多嚙齒類的HCC動物模型中已經(jīng)證實了在HCC的形成前優(yōu)先出現(xiàn)HOC的增殖，各種各

2、樣的化學致癌物誘導的實驗性動物肝臟形成腫瘤，其癌變的過程主要為致癌物抑制了正常肝細胞的增殖和修復功能，而卵圓細胞活化、增殖，代替肝細胞的功能修復嚴重受損的肝臟組織。并且慢性肝臟疾病中出現(xiàn)HPCs的增殖增加了HCC形成的風險。HPCs被發(fā)現(xiàn)參與一系列肝臟損傷性疾病，并且在肝纖維化和肝臟腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。富半胱氨酸蛋白61(Cysteine rich61，Cyr61/CCN1)是CCN蛋白家族成員之一，是分泌型的、細胞外基質蛋白，參與

3、調節(jié)細胞的多種生物學進程，如分化、轉移、增殖、血管形成、細胞粘附、存活和凋亡。在干細胞中，Cyr61是主要信號通路的介導者。但是，Cyr61和肝臟祖細胞的具體關系仍不清楚。同樣Cyr61被發(fā)現(xiàn)在多種類型的腫瘤組織中過表達并且在腫瘤形成的過程中Cyr61發(fā)揮多種不同的功能。但是目前，Cyr61在HCC中的作用仍存在爭議，并且兩者的確切關系及其機理尚不清楚。本研究首先分析了HCC組織、癌周肝硬化組織和正常成人肝臟組織中Cyr61的表達和HP

4、Cs活化的關系。然后對Cyr61在2-AAF/PHx大鼠肝損傷模型中對HOC活化增殖的作用及其機制進行初步研究。最后，觀察并分析了Cyr61調控肝干細胞增殖的作用和機制以及Cyr61對HepG2細胞在NOD/SCID小鼠體內成瘤的作用。本研究不僅為深入研究Cyr61在HPCs/HOC應答以及肝臟腫瘤形成中發(fā)揮的生物學效能及機制奠定了基礎，并且對尋找肝癌早期診斷的標志物和治療的靶點具有重要的臨床意義。
　　 方法：
　　

5、1.病人標本中Cyr61的表達和HPCs活化增殖的關系的研究
　　 1.1采用HE、免疫組織化學SP染色法檢測5例正常成人肝臟組織，30例癌周肝硬化組織，35例HCC組織中HPCs活化增殖的情況。
　　 1.2免疫組織化學SP染色法檢測Cyr61在5例正常成人肝臟組織，30例癌周肝硬化組織，35例HCC組織中的表達情況，并進行半定量分析Cyr61表達的差異，分析人肝臟組織中Cyr61表達和HPCs增殖的關系。
　　

6、 1.3免疫組織化學SP染色法、免疫熒光雙標激光共聚焦檢測的方法觀察病人標本中Cyr61在活化的HPCs中的表達情況。
　　 2.Cyr61在2-AAF/PHx大鼠肝損傷模型中對HOC活化增殖的作用及其機制的初步研究。
　　 2.1檢測分析2-AAF/PHx大鼠肝損傷模型肝臟組織中Cyr61的表達和HOC活化增殖的關系。
　　 2.1.1 HE、免疫組織化學SP染色法，檢測HOC在2-AAF/PHx大鼠模型肝臟

7、組織中活化增殖的情況。
　　 2.1.2采用免疫組織化學SP染色、組織透射電鏡觀察的方法，對2-AAF/PHx大鼠模型肝臟中活化增殖的HOC進行鑒定。
　　 2.1.3 Western blotting的方法檢測Cyr61在2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中HOC活化增殖過程中的表達情況以及β-catenin信號通路的異常激活情況。
　　 2.22-AAF/PHx大鼠肝損傷模型中下調Cyr61的異常表達對β-c

8、atenin信號通路的抑制作用及HOC增殖的影響的檢測及分析。
　　 2.2.1應用肝臟原位注射并孵育Cyr61抗體的方法，抑制2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中Cyr61的異常表達。
　　 2.2.2 Western blotting檢測2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中Cyr61是否被抑制。
　　 2.2.3 Western blotting檢測2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中下調Cyr61的表達后，

9、β-catenin以及其下游靶基因cyclinD1表達水平的變化。
　　 2.2.4組織HE染色的方法檢測2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中下調Cyr61的表達對HOC的激活和增殖的影響。
　　 3.Cyr61調節(jié)HOC和肝癌細胞株HepG2增殖作用的研究。
　　 3.1 HOC的分離、培養(yǎng)、鑒定以及Cyr61調控HOC增殖作用及其機制的初步研究。
　　 3.1.1兩步膠原酶消化法分離培養(yǎng)2-AAF/P

10、Hx大鼠模型肝臟組織中增殖的HOC；免疫熒光染色法、透射電鏡法，對分離的HOC進行鑒定。
　　 3.1.2應用HEK293細胞對重組腺病毒AdCyr61、AdRFP進行擴增，細胞感染及滴度測定，并用獲得的病毒裂解液感染HOC獲得瞬時高表達外源性Cyr61的AdCyr61-HOC以及對照細胞AdRFP-HOC。
　　 3.1.3 Western blotting檢測AdCyr61感染HOC后細胞中Cyr61的表達情況。MT

11、T實驗檢測Cyr61對HOC增殖的影響。
　　 3.1.4 Western blotting檢測AdCyr61-HOC和AdRFP-HOC中β-catenin信號通路的活化情況。
　　 3.1.5分別用AdCyr61瞬時感染和抗體封閉的方法過表達和抑制HOC中Cyr61的表達后，用雙熒光素酶報告基因的方法檢測β-catenin/TCF轉錄活性的變化。
　　 3.2 NOD/SCID小鼠皮下瘤實驗觀察分析體內Cyr

12、61對HepG2細胞成瘤作用的影響。
　　 3.2.1人肝癌細胞株HepG2分別被AdCyr61、AdRFP感染36h后，分別采用RT-PCR、Western blot的方法檢測感染AdCyr61的實驗組HepG2細胞中Cyr61的mRNA和蛋白的表達和對照組細胞AdRFP-HepG2相比是否上調。
　　 3.2.2將AdCyr61-HepG2細胞和AdRFP-HepG2接種于NOD/SCID小鼠皮下，觀察Cyr61對皮

13、下瘤生長的影響并繪制皮下瘤成長曲線。
　　 3.2.3采用HE、免疫組織化學SP染色法分別檢測Cyr61對HepG2皮下瘤形態(tài)的影響以及核增殖因子Ki67的變化。
　　 結果：
　　 1.5例(100％)正常成人肝臟組織中均未發(fā)現(xiàn)門脈周圍HPCs和非典型小管樣增殖(atypical ductular proliferations，ADP)反應；30例(100%)癌周肝硬化組織中均出現(xiàn)明顯的HPCs的激活和ADP反

14、應；25例(71%)HCC組織中存在HPCs的激活和ADP反應。并且在癌周肝硬化和HCC組織中，增殖的HPCs起源于肝門脈區(qū)域，隨著門脈炎癥程度加重，HPCs及小管樣反應從肝硬化結節(jié)或癌結節(jié)周圍向肝實質擴散。
　　 2.Cyr61在癌周肝硬化組織中的表達明顯升高，并且在增生的間質中可見大量激活的單個HPCs和呈小管樣反應的HPCs，Cyr61在其中也均為強陽性表達；HCC中癌結節(jié)周圍的間質中也出現(xiàn)了HPCs的大量增生和同樣的小管

15、樣反應，周圍伴有炎細胞浸潤，并且Cyr61在HPCs中的表達和癌細胞相比顯著增高。
　　 3.HE染色觀察細胞形態(tài)和免疫組織化學SP染色法檢測HPCs標志蛋白OV6，共同分析病人標本中出現(xiàn)HPCs激活和ADP反應的情況，發(fā)現(xiàn)HPCs激活和增殖的程度與Cyr61表達的升高相伴隨，并且Cyr61和OV6在HPCs中共表達。
　　 4.2-AAF/PHx大鼠模型中，部分肝切除(partial hepatectomy，PH)后第

16、2d在門脈區(qū)就出現(xiàn)HOC的增殖，主要為單個或散在的HOC，PH后第9d，HOC進一步活化增殖，形成的小管樣結構大量增加，侵入肝實質中部，OV6免疫組織化學SP染色胞漿呈強陽性表達，第21d已經(jīng)基本恢復正常。
　　 5.Cyr61在2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中HOC活化增殖過程中的表達上調，Cyr61的表達在PH后第1d即開始增高，PH后第3d、5d、7d達高峰，PH第9d后逐漸恢復正常值。
　　 6.β-cate

17、nin信號通路在2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中HOC活化增殖過程中異常激活，其關鍵分子GSK-3β的表達沒有發(fā)生變化，但是其發(fā)生磷酸化與Cyr61的異常表達一致，并且β-catenin的激活也和Cyr61的異常表達相伴隨。β-catenin信號通路下游和HOC增殖相關的靶基因CyclinD、Survivin和Cyr61的異常表達也一致，均伴隨著HOC的活化增殖而升高。
　　 7.下調2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中Cy

18、r61的表達可以抑制β-catenin、CyclinD的異常表達并使HOC的增殖減少。
　　 8.PH后第9d的2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中分離培養(yǎng)了增殖的HOC并進行了鑒定和培養(yǎng)，過表達外源性的Cyr61后，GSK-3β的磷酸化水平升高呈失活形式，β-catenin的磷酸化水平降低而活性升高，外源性的Cyr61可以促進細胞增殖并可以使β-catenin/TCF的轉錄活性顯著升高，并且β-catenin下游靶基因Cycl

19、inD、Survivin的表達升高。
　　 9.外源性的Cyr61可以促進肝癌細胞株HepG2在NOD/SCID小鼠皮下瘤的生長，并且使皮下瘤組織Ki67的表達增多，提示Cyr61在體內可以促進HCC的生長。
　　 結論：
　　 1.在正常肝組織中無門脈周圍HPCs和ADP增殖。在癌周肝硬化和HCC組織中，增殖的HPCs起源于肝門脈區(qū)域，隨著門脈炎癥程度加重，HPCs及小管樣反應從肝硬化結節(jié)或癌結節(jié)周圍向肝實質擴

20、散，并且Cyr61在激活的HPCs中表達異常增高。提示Cyr61在HCC形成過程中發(fā)揮的重要作用可能和HPCs的激活有密切的關系。
　　 2.2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中Cyr61的表達在HOC活化增殖的過程中明顯升高，當HOC分化為正常肝細胞或膽管細胞后又恢復正常水平，并且β-catenin信號通路的異常激活和Cyr61的升高相伴隨，提示Cyr61可能和β-catenin協(xié)同作用，在激活HOC，促進其增殖方面發(fā)揮重要的

21、作用，并共同促進HOC的活化增殖；采用抗體封閉的方法下調2-AAF/PHx大鼠模型肝臟組織中Cyr61的表達可以抑制β-catenin信號的異常激活并使HOC的增殖減少，提示Cyr61對HOC活化增殖作用可能依賴于β-catenin的異常激活啟動下游靶基因來實現(xiàn)。
　　 3.外源性Cyr61在體外可以促進HOC的增殖，并可以減少β-catenin的磷酸化降解，調節(jié)β-catenin/TCF轉錄活性，促使其作用于下游增殖因子發(fā)揮作