穿心蓮內酯干預銅綠假單胞菌BF形成及QS系統(tǒng)相關基因表達的實驗研究.pdf

1、目的:
　　1．觀察穿心蓮內酯對銅綠假單胞菌生物被膜（BF）形成的干預作用，并分析藥物對 BF的干預作用與細菌群體感應（QS）系統(tǒng)的相關性，在分子水平探討穿心蓮內酯的作用機制。
　　2．觀察穿心蓮內酯提高左氧氟沙星抗 BF陽性銅綠假單胞菌活性的作用，探討穿心蓮內酯作為抗菌增效劑的可行性。
　　方法:
　　1．以銅綠假單胞菌PAO1野生株為研究對象，首先采用電鏡技術（掃描電鏡SEM和透射電鏡TEM）觀察穿心蓮內酯在

2、300、30、3μg·mL－1劑量下對PAO1所生成的BF形態(tài)學的影響；其次采用96孔板定量測定法，定量檢測穿心蓮內酯在300、250、200、150、100、50、25、15、10、5μg·mL－110個劑量下，對72 h內PAO1形成BF厚度的影響；最后構建體外BF滲透模型，觀察穿心蓮內酯在300、30、3μg·mL－1劑量下，在構建的BF模型上對左氧氟沙星滲透性的影響。以此綜合分析和評價穿心蓮內酯對銅綠假單胞菌 BF的干預作用。<

3、br>　　2．采用實時定量熒光PCR(Real-Time PCR)技術觀察穿心蓮內酯在150、75、37.5μg·mL－1劑量下對銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)中相關基因lasR和rhlR，以及調節(jié)基因pvdQ的mRNA表達水平的影響，分析藥物對BF的干擾是否與QS系統(tǒng)相關。
　　3．采用傳統(tǒng)的體外藥物敏感性實驗，觀察穿心蓮內酯與左氧氟沙星不同配比的22個樣品對160株臨床近期分離BF陽性銅綠假單胞菌的MIC值，并采用概率單位分析法，對受試

4、藥物效價強度進行擬合，以殘差平方和和相關系數(shù)為主要判別，進行線性、對數(shù)性、Emax和Sigmod Emax的對比，評價不同配比受試藥物的抗菌活性；以PAO1構建小鼠銅綠假單胞菌腹腔感染模型，觀察體外抗菌活性較強的13個配比受試藥物的體內抗感染作用。
　　4．采用體內炭粒廓清實驗，以吞噬指數(shù)為指標觀察穿心蓮內酯對正常小鼠網(wǎng)狀內皮細胞吞噬功能的影響；采用巨噬細胞體外培養(yǎng)實驗，觀察穿心蓮內酯體外對巨噬細胞吞噬作用的影響。
　　結果

5、:
　　1．SEM結果顯示，空白對照組PAO1附著于玻璃載體表面在72 h可形成分化成熟、較厚、結構不均勻并密布有孔狀通道的BF， TEM鏡下可見PAO1聚集生長，菌體邊緣清晰，周圍可見呈團塊，形態(tài)似“塔狀”或“蘑菇狀”的不規(guī)則BF結構，未見明顯的培養(yǎng)基染色顆粒。穿心蓮內酯3μg·mL－1劑量下,PAO1產(chǎn)生的BF未能形成成熟的結構，BF明顯稀薄且平整，可見附著的PAO1菌體， TEM鏡下PAO1有一定的聚集，可見少量“蘑菇狀”B

6、F結構，但較小且不明顯；在穿心蓮內酯30、300μg·mL－1劑量下，PAO1分散附著，均未見明顯的BF結構，TEM鏡下PAO1多數(shù)分散生長，少見聚集，菌體邊緣不清晰，周圍有大量顆粒狀物質。
　　2．穿心蓮內酯在300、250、200、150、100、50、25、20、10、5μg·mL－110個劑量下，72 h內均可影響 PAO1 BF的生長。穿心蓮內酯在20μg·mL－1以上劑量下，12、24、36、48、60、72 h時 B

7、F厚度明顯變薄。
　　3．BF滲透性實驗顯示，穿心蓮內酯在300、30、3μg·mL-1劑量下均可以提高銅綠假單胞菌生物被膜模型對左氧氟沙星的滲透性，在模型構建后的2、4、6、8、10、24 h的藥物滲透量顯著升高。
　　4.實時定量熒光PCR測定結果顯示，穿心蓮內酯在150μg·mL-1濃度下增強lasR基因表達，30、3μg·mL-1劑量下則降低其表達；穿心蓮內酯在300、30和3μg·mL-1的劑量下均可降低rhlR和

8、pvdQ基因的表達；
　　5.體外藥物敏感性實驗結果顯示,在左氧氟沙星比穿心蓮內酯在1:0.001～1:0.01范圍內，藥物的Emax和 ED50雖然有一定的波動，但總體趨勢上表現(xiàn)出Emax高于單用左氧氟沙星和ED50低于單用左氧氟沙星，表明穿心蓮內酯在一定劑量范圍內有提高左氧氟沙星抗菌活性的作用。體內細菌感染保護性實驗結果顯示，所觀察的13組配方對銅綠假單胞菌小鼠感染模型的體內保護性作用均優(yōu)于左氧氟沙星單用。體內與體外實驗結果表