不同產區(qū)皺皮木瓜有機酸組成及主要活性成分分離純化研究.pdf

1、皺皮木瓜(Chaenomeles speciosa(Sweet) Nakai)是薔薇科(Rosaceae)蘋果亞科(Maloideae)木瓜屬(Chaenomeles)多年生落葉小喬木，原產于亞洲東部，世界各地均有分布，是我國南北各地廣范栽培的重要果樹資源。皺皮木瓜果實營養(yǎng)豐富、氣味芳香，富含超氧化物歧化酶、齊墩果酸、熊果酸、黃酮類、皂甙類、有機酸類等多種活性成分，是一種藥食兼用的水果類型。然而皺皮木瓜果肉維管系統(tǒng)發(fā)達、石細胞豐富、有機

2、酸含量極高，質地堅硬、口感酸澀，除藥用外，難以作為鮮食水果供人們食用，由此造成大量的野生皺皮木瓜資源浪費。隨著近年來國內外植物提取物市場需求量的激增，以皺皮木瓜果實為原料進行活性成分的規(guī)?；a已成為我國皺皮木瓜果樹資源產品深度開發(fā)的新方向；同時作為薔薇科典型高酸果樹品種，對皺皮木瓜果實高酸積累機理的探索研究，可以為蘋果亞科近緣果樹果實有機酸代謝及調控研究提供基礎數(shù)據(jù)。但國內外對皺皮木瓜果實活性成分的提取、分離純化工藝研究及果實有機酸代

3、謝均在不同程度上受到研究方法陳舊和技術手段落后等瓶頸問題制約，尚處于起步階段。
　　 代謝組學(Metabonomics/Metabolomics)研究技術是對某一生物或細胞在特定生理時期內所有低分子量代謝產物同時進行定性和定量分析的一門新學科，它是以組群指標分析為基礎，以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標的系統(tǒng)生物學分支，適用于生物體復雜組分代謝機理的研究。低溫超聲萃取技術(Low-temprature U

4、ltrasound Extracting Technology)是近年來發(fā)展起來的一種新型分離技術，它是在低溫條件下通過空化效應實現(xiàn)對萃取的強化作用，在超聲場中空化效應產生的微小氣泡瞬間被激活，一系列動力學過程伴隨超聲空化產生的微射流、沖擊波等機械效應，加快兩相間的傳質速度，從而促進細胞內有效成分的溶出。離心分配色譜(Centrifugal Partition Chromatography，CPC)屬于現(xiàn)代液液逆流分配色譜的一種，高效離

5、心分配色譜技術(High Performance Centrifugal Partition Chromatography，HPCPC)是由離心分配色譜發(fā)展來的液相色譜新技術，具有很強的分離純化性能，已被廣泛應用于天然產物和中藥有效成分的分離純化。但以上技術迄今均鮮見于皺皮木瓜果實開發(fā)方面的研究報道。
　　 本論文以我國特色果樹資源皺皮木瓜為試材，利用基于RP-HPLC-PDA檢測平臺與GC-MS檢測平臺的植物代謝組學研究技術對

6、皺皮木瓜果實中的水溶性和脂溶性有機酸的組成、含量波動范圍以及果實全發(fā)育期主要有機酸代謝規(guī)律進行探索研究，獲得了代表樣品有機酸組分定性定量檢測數(shù)據(jù)、全國十個道地產區(qū)12批樣品有機酸組成和含量差異數(shù)據(jù)及重慶皺皮木瓜全發(fā)育期果實有機酸代謝規(guī)律數(shù)據(jù)，分析了皺皮木瓜果實高酸積累機制；同時利用現(xiàn)代低溫超聲萃取技術、高效離心分配色譜分離技術、高效液相色譜以及氣相.質譜聯(lián)用檢測技術，對其果實超氧化物歧化酶、齊墩果酸熊果酸、揮發(fā)油等3大類活性成分進行了提

7、取、分離純化和鑒定研究，并進行皺皮木瓜果實SOD酶學性質檢測、齊墩果酸熊果酸提取工藝優(yōu)化和純度鑒定以及揮發(fā)油組成和含量檢測，完善相關工藝并獲得相應數(shù)據(jù)。有關研究結果如下：
　　 1.不同產區(qū)皺皮木瓜有機酸組成檢測及全發(fā)育期果實有機酸代謝規(guī)律
　　 采用HPLC-PDA法共檢出皺皮木瓜水溶性有機酸13種，采用GC-MS共檢出其脂溶性有機酸43種，方法穩(wěn)定可靠。國內十個道地產區(qū)12批樣品水溶性有機酸總含量范圍為：119.84

8、1～276.046mg·g-1，四川儀隴最高而重慶綦江三角最低；樣品脂溶性有機酸總含量以山東沂州最高而陜西白河最低；聚類分析篩選出水溶性有機酸和脂溶性有機酸高、中、低酸典型品種各一組，且其組成各不相同。采用代謝組學方法研究重慶皺皮木瓜果實不同生長期水溶性與脂溶性有機酸的動態(tài)變化，結果表明：在果實發(fā)育前期兩類有機酸的種類和數(shù)量隨時間的增高而提高，7月中下旬達高最高水平，果實成熟期時隨生長時間迅速減少；全發(fā)育期蘋果酸、富馬酸與水溶性總有機酸

9、積累過程呈顯著正相關，而α-酮戊二酸與之呈負相關；蘋果酸、檸檬酸、奎尼酸等9種與果實脂溶性有機酸積累過程呈顯著正相關，而戊酸與之呈負相關，說明蘋果酸是皺皮木瓜果實高酸積累的關鍵因子。本節(jié)建立了皺皮果實有機酸代謝組學基本研究方法，揭示了重慶皺皮木瓜全發(fā)育期果實有機酸代謝規(guī)律。
　　 2.皺皮木瓜超氧化物歧化酶提取工藝優(yōu)化與酶學性質檢測
　　 皺皮木瓜果實超氧化物歧化酶最佳提取工藝為：以pH=9.32的0.05mol·L-1

10、磷酸氫二鈉溶液作為提取溶劑，料液比1:3，以聚乙烯聚吡咯烷酮作為果實酚類物質吸附劑，采用低溫(0℃)超聲(800W)萃取處理20min，目標酶蛋白提取率達到最大值。皺皮木瓜果實超氧化物歧化酶蛋白分子量約為38.5kD，在347nm波長處具有特征性紫外吸收峰，且雙氧水和氯仿-乙醇(3：5)對目標酶蛋白活性具有明顯抑制作用而氰化物作用不明顯，因此初步皺皮木瓜超氧化物歧化酶為鐵型SOD；同時酶液在60℃恒溫水浴中酶活保持時間約為10-15mi

11、n，在pH=6.0-9.0酸度范圍內目標酶蛋白活性較穩(wěn)定。本研究有效消除了多酚與高酸對皺皮木瓜超氧化物歧化酶溶出率的抑制，明確了皺皮木瓜超氧化物歧化酶的酶學性質。
　　 3.皺皮木瓜齊墩果酸和熊果酸提取純化與高效離心分配色譜分離
　　 皺皮木瓜齊墩果酸和熊果酸最佳提取工藝為：以95％乙醇作提取溶劑，料液比1:30，250W60℃超聲處理20min，目標化合物提取率達到最大；總浸提物經過堿溶酸沉與氯仿萃取處理可使目標提取物

12、得到進一步純化；以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(7:3:5:1，V/V)作為兩相系統(tǒng)，下相作為固定相，上相作為流動相，采用上行模式洗脫，在流動相流速1.5mL·min-1、轉速1000rpm條件下，齊墩果酸和熊果酸混合物在180min內得到有效分離，餾份重結晶后高效液相色譜儀純度鑒定結果分別為96.9％與94.3％。本研究解決了皺皮木瓜三萜類成分同分異構體分離的難題。
　　 4.皺皮木瓜揮發(fā)油提取與分離鑒定
　　 采用水蒸

13、汽蒸餾法提取皺皮木瓜鮮果揮發(fā)油，提取率約為0.016％；氣相-質譜聯(lián)用儀分離鑒定出樣品揮發(fā)油組分106種，其中酯類物質(52種)占80.95％、醇類物質(18種)占6.16％、羧酸類(12種)占4.80％、烷烴和烯烴類(14種)占4.29％、酮類(3種)占1.62％，及少量萘類、吡喃類、醛類成分。皺皮木瓜果實揮發(fā)油提取率低于光皮木瓜(0.022％)，皺皮木瓜果實極性揮發(fā)油組成與光皮木瓜相似但含量低于光皮木瓜，弱極性揮發(fā)油組分數(shù)量高于光皮