草魚呼腸孤病毒誘導FHM細胞凋亡及表達VP6蛋白重組桿狀病毒的構建.pdf

1、草魚呼腸孤病毒(Grass Carp reovirus，GCRV)是由我國分離鑒定的第一株魚類病毒，也是目前水生呼腸孤病毒屬中致病力最強的病毒之一，該病毒不僅感染草魚，而且還可以感染鰱魚、布氏鰲條魚，給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經濟損失。
　　 本研究圍繞GCRV誘導細胞凋亡和桿狀病毒載體疫苗兩個方面展開了以下研究:
　　 1.GCRV誘導FHM細胞凋亡的初步研究
　　 將GCRV分別感染草魚腎細胞(Ctenopha

2、ryngodon idellus kidney cell，CIK)和胖頭鯉細胞(Fathead minnow cell，FHM)，在不同時間點觀察細胞病變效應，發(fā)現GCRV均可引起這兩種細胞病變，但發(fā)生病變的細胞在形態(tài)上有所不同，GCRV對CIK細胞更為敏感，可以使感染的CIK細胞快速融合并裂解，而被感染的FHM細胞很少有細胞融合，并且細胞不會被裂解;利用DAPI、Annexin V-FITC染色和TUNEL技術進一步證實GCRV能夠誘

3、導FHM細胞發(fā)生細胞凋亡，但不能誘導CIK細胞發(fā)生細胞凋亡。本研究首次發(fā)現GCRV可以誘導FHM細胞發(fā)生凋亡，并推測GCRV在感染不同類型的細胞時，可以以不同機制促使細胞死亡，從而為進一步研究GCRV的致病機制提供線索。
　　 2.表達GCRV VP6蛋白的重組桿狀病毒構建及其誘導草魚免疫反應的評價
　　 克隆GCRV VP6基因，并將其插入桿狀病毒轉移質粒，構建重組轉移質粒pFast-CMV-VP6，將其轉化至感受態(tài)細

4、胞DH10Bac后，經過多次篩選及純化，獲得陽性重組子rBacmid-CMV-VP6;將重組子在脂質體介導下轉染昆蟲細胞sf9，最后獲得重組桿狀病毒Bae-CMV-VP6;將重組桿狀病毒Bac-CMV-VP6感染sf9、EPC和CIK細胞，通過間接免疫熒光檢測，證明VP6蛋白均可以在這三種細胞中進行表達;將該重組桿狀病毒免疫10-15cm草魚，劑量為109 PFU/條，并在免疫后第7d、14d、21d采集免疫魚的肝臟和脾臟，利用熒光定量