小麥TaSSP1基因的克隆、原核表達及生理功能初步鑒定.pdf

1、本實驗室在研究小麥葉片衰老過程中蛋白水解酶同工酶的變化時，發(fā)現(xiàn)一種了性質(zhì)較為穩(wěn)定的蛋白酶。進而純化了該蛋白酶，并通過質(zhì)譜鑒定以及對所得數(shù)據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，結(jié)果顯示其屬于枯草桿菌類(subtilisin-like)絲氨酸型蛋白酶，因此命名為TaSSP1(Triticum aestivum Subtilisin-like Serine Protease1);隨后，通過對該蛋白酶抗原性分析，以其mRNA序列設計兼并引物，克隆到了與該蛋

2、白酶抗原性相關的718bp基因片段(Triticum aestivum Subtilisin-like Serine Protease1-fragment，TaSSP1-f).接著，在此基礎上，成功地在大腸桿菌中表達了該基因片段的蛋白產(chǎn)物，并制得了該蛋白酶片段的抗血清.近期，通過RACE(rapid amplification of cDNA ends)方法，成功獲得了該蛋白酶基因的全序列，該序列全長為2361bp。
　　 本論

3、文工作在上述研究基礎上，首先，對去除信號肽的TaSSP1全基因序列以及其不同結(jié)構(gòu)域的基因序列進行了原核表達，獲得該蛋白酶的不同蛋白片段，然后通過活性分析等研究，以期闡明該蛋白酶激活的結(jié)構(gòu)學機制。其次，分別從核酸和蛋白水平對小麥體內(nèi)該蛋白酶的表達情況進行分析鑒定，以期進一步明確該蛋白酶的生理功能。
　　 通過Signa14.0軟件分析，知道上述蛋白酶序列的前27個氨基酸序列是該蛋白的信號肽區(qū)域。然后，將去除信號肽的TaSSP1基因

4、重組到表達載體pET24b上，成功構(gòu)建了pET24b-TaSSP1-31-786重組表達質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta中誘導表達，誘導條件:溫度30℃，時間3h， IPTG濃度為0.5 mM。在菌液OD600值為0.8左右時，超聲破碎菌體后通過SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)菌液中誘導表達的蛋白分子量（約56KD）比理論蛋白的分子量(78KD)要小。而western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，誘導表達的蛋白可以和本實驗室制備的該蛋白酶

5、片段抗血清進行免疫結(jié)合。同時根據(jù)該蛋白酶不同結(jié)構(gòu)域的基因序列結(jié)構(gòu)，分別構(gòu)建了pET24b-TaSSP1-133-450，pET24b-TaSSP1-133-786兩個重組質(zhì)粒，并按照上述相同方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta中誘導表達，相同條件下超聲破碎菌體后通過SDS-PAGE電泳檢測，但結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)表達的預期相應蛋白。
　　 在TaSSP1基因生理功能的研究中，實驗材料為揚麥158，小麥生長采用定期灌澆Hoagland營養(yǎng)液的水

6、培方式，在小麥長至15天時，營養(yǎng)液中分別加入10μM脫落酸ABA(Abscisic Acid)與22μM6-芐氨基嘌呤6-BA(6-Benzyl Aminopurine)對小麥進行處理。然后取不同處理時間的小麥葉片（僅取小麥第三片葉），提取RNA，采用半定量和熒光定量RT-PCR兩種方法分析在不同的激素和不同時間處理下，小麥TaSSP1在轉(zhuǎn)錄水平上表達量的變化。結(jié)果顯示，在ABA處理條件下，隨著處理時間的增加從0h、1h、3h、到7h，

7、TaSSP1基因在RNA水平的表達有逐漸增加的趨勢，然后恢復到天然水平;而在6-BA處理下，在處理的72h內(nèi)，除1h外，隨著處理時間的增加，TaSSP1基因的RNA表達水平呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。
　　 同樣條件下取不同激素和不同時間處理的小麥葉片，提取小麥葉片的粗酶液為樣液，分別采用SDS-PAGE和Western-blot方法，檢測了小麥枯草桿菌類絲氨酸型蛋白酶TaSSP1蛋白水平表達的變化情況。結(jié)果顯示，在ABA處理后的0到12

8、h時，小麥TaSSP1基因在蛋白水平上的表達量呈現(xiàn)增加趨勢，而后到72h內(nèi)一直保持比對照高的水平;而6-BA處理后的0h到7h內(nèi)，小麥TaSSP1基因在蛋白水平上的表達量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，而后的72h內(nèi)一直保持在比對照低的水平上。
　　 在小麥長至15天時，取去除其兩端的小麥第三片葉，暗處理1、2、3和4天后，進行Western-blot和含明膠的5％-15％濃度梯度的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析鑒定，結(jié)果顯示，隨著暗處理時間的增加