慢病毒介導的RNAi轉基因羊鑒定方法的優(yōu)化及卵巢注射慢病毒母羊安全性初步檢測.pdf

1、從Jaenisch通過對小鼠囊胚注射SV40DNA，構建了整合有SV40DNA的小鼠開始，到現(xiàn)在利用重組慢病毒載體跟同源重組技術構建各種轉基因動物，越來越多的轉基因動物被制造出來。轉基因動物的構建必然伴隨著轉基因動物的鑒定，雖然轉基因動物的鑒定技術沒有轉基因動物構建技術一般突飛猛進，但是，轉基因檢測技術也在向著更快、更可靠、更簡便、更便宜的方向發(fā)展著。
　　 隨著轉基因技術的發(fā)展，轉基因動植物的不斷出現(xiàn)，轉基因生物產品陸續(xù)的商業(yè)

2、化，轉基因逐漸在從實驗室走向大家的生活中。但是，轉基因生物的安全性，特別是轉基因動物的安全問題一直是社會廣泛關注的焦點，也是轉基因產品能否實現(xiàn)產業(yè)化的關鍵問題，建立轉基因動物及其產品安全評價體系有利于加快人們對轉基因食品的認可度。
　　 本研究應用PCR、Southern Blot、基因測序以及血常規(guī)檢測等技術，在DNA水平對實驗室構建的慢病毒介導的RNAi轉基因羊進行了鑒定并建立了一種對實驗條件要求不高的檢測方法。并且，對卵巢

3、注射有慢病毒的母羊做了轉基因動物安全性檢測，證明了外源基因并沒有在母羊體內發(fā)生轉移，而且慢病毒載體對母羊的健康也沒有造成影響。
　　 本研究內容包括以下兩個部分：
　　 1.慢病毒介導的RNAi轉基因羊的鑒定與鑒定方法建立
　　 針對本實驗室之前通過原核顯微注射將MSTN及INHA基因慢病毒RNAi載體注射到羊的受精卵中，并將這些受精卵在體外培養(yǎng)48h后，移植到受體母羊中，最后得到了18頭小羊。提取小羊的組織DN

4、A，在DNA水平通過PCR技術與SouthernBlot技術對這批小羊進行了慢病毒上的BSD基因的特異性轉基因鑒定，雖然得到的最終結果為沒有轉基因羊出生。但是，通對這批小羊進行轉基因動物鑒定，在本實驗室建立了轉基因動物鑒定技術平臺，并利用地高辛試劑盒對Southern Blot技術的實驗條件與實驗流程進行了改進，即將200mA電轉系統(tǒng)引入DNA的轉膜實驗中，證明電轉8h可以有效的將瓊脂糖凝膠上的DNA轉移到尼龍膜上，12h后可以完全轉移

5、。且在不影響實驗可靠性與靈敏度的情況下，利用實驗室常用儀器恒溫搖床與烘箱進行適當?shù)目販嘏c時間調節(jié)代替了水浴搖床與紫外交聯(lián)雜交儀完成實驗，降低了該實驗對實驗條件的要求，建立了對實驗條件要求低，操作簡便，可靠性高的慢病毒介導的RNAi轉基因動物鑒定方法。
　　 本實驗成功的在本實驗室建立慢病毒介導的RNAi轉基因羊檢測技術平臺，并且對Southern Blot進行改進，在不影響實驗效果的情況下，利用簡單、常用儀器代替了昂貴、復雜的儀

6、器，并將200mA電轉系統(tǒng)引入DNA的轉膜實驗，使得該技術更易操作，實驗要求降低。
　　 2.卵巢注射慢病毒載體的母羊的安全性檢測
　　 本實驗對母羊的兩側卵巢注射了0.25mL慢病毒培養(yǎng)液，6個月后采母羊頸靜脈，將新鮮血液進行血常規(guī)檢測并提取血液組織DNA，旨在檢測注射慢病毒載體的母羊特異性基因BSD基因的整合情況，了解注射慢病毒載體的轉基因母羊的安全性。血常規(guī)檢測結果為實驗組母在白細胞數(shù)，紅細胞數(shù)等指標差異并不顯著，