家蠶促咽側體素受體鑒定及相關神經肽受體基因的發(fā)育表達.pdf

1、昆蟲神經肽及其G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)在調控其生長、發(fā)育、生殖、神經傳導、代謝以及行為等方面起重要的作用，是綠色農藥設計重要的靶基因。促咽側體素是家蠶重要神經肽，其主要的生理功能是促進保幼激素的合成和分泌，加速心臟搏動，抑制活性離子運輸等。把昆蟲促咽側體素的受體作為靶基因研究高活性的昆蟲生長調節(jié)劑具有重要的意義。本文克隆并鑒定了家蠶神經肽促咽側體素的G蛋白偶聯(lián)受體基因(Allatotropin receptor，Bom-ATR)，調查

2、其發(fā)育變化；然后系統(tǒng)地研究了家蠶其他16種相關的神經肽受體基因的發(fā)育表達模式。
　　家蠶促咽側體素受體基因開放閱讀框全長為1254bp，編碼416個氨基酸。Bom-ATR氨基酸序列的二級結構預測為7次穿膜蛋白，符合GPCR家族成員的典型特征。預測家蠶ATR的3-D結構結果表明其包含18個螺旋，其中主要的α-螺旋有7個，與7次跨膜結構一致。家蠶的ATR與煙草天蛾的ATR關系最接近，其次為家蠶神經肽受體BNGR-5，家蠶的ATR與埃及

3、伊蚊、小金蜂、赤擬谷盜的ATR距離較遠，這與傳統(tǒng)的系統(tǒng)關系一致。把Bom-ATR的ORF插入到pcDNA5-FRT質粒中，構建pcDNA5-FRT-Bom-ATR-ORF重組質粒，轉染HEK細胞株，與家蠶AT結合分析表明，AT與Bom-ATR結合Ca2+產生明顯的應答，Ca2+的響應曲線呈現(xiàn)出劑量依賴型，AT與Bom-ATR作用的EC50值為2.16nM，證明克隆的Bom-ATR是AT的G蛋白偶聯(lián)受體。
　　實時熒光定量PCR結果

4、表明，家蠶腦-咽下神經節(jié)復合體中的ATR mRNA在5齡幼蟲期表達量最高，其次為蛹后期，蛹前期和成蟲階段表達量最低。其中5齡幼蟲第2天表達量最高，5齡1-5天持續(xù)維持較高的表達水平，這可能與保幼激素的合成有關。
　　調查了其他15種神經肽G蛋白偶聯(lián)受體基因在家蠶腦-咽下神經節(jié)復合體中的發(fā)育表達模式，不同神經肽G蛋白偶聯(lián)受體基因發(fā)育表達模式明顯有差別。所調查的16種神經肽基因中，sNPF1等7個受體基因在5齡前期表達量高，預蛹期高表