圍產期奶牛外周血液學及免疫相關細胞因子和TLR-4基因表達規(guī)律的研究.pdf

1、圍產期是奶牛管理上的一個重要階段，其管理水平直接影響到產后的繁殖和泌乳性能。奶牛圍產期外周血白細胞功能發(fā)生一定程度的紊亂，其主要表現為淋巴細胞、中性粒細胞免疫功能減弱。目前對該階段的研究主要集中在能量負平衡以及飼料添加劑等方面，而對于該階段奶牛機體血液學指標及機體免疫力相關基因表達研究國內還存在空白，尤其是圍產期階段淋巴細胞、中性粒細胞相關調節(jié)基因表達的研究還未見報道。在分析和綜述了先前研究的基礎上，本研究以產前21天、14天、7天、產

2、犢當天0天、產后7天、14天和21天7個時間點的外周血淋巴細胞、中性粒細胞為研究對象，通過RT-PCR、FCM和WB等手段對調節(jié)外周血中性粒細胞(PMN) TLR-4通路(TLR-4，CD14，MD-2)基因、淋巴細胞中CD3+、CD4+、CD8+及IL-2和IL-4細胞因子的表達來進行了研究，以期通過闡明圍產期外周血中淋巴細胞、中性粒細胞及機體免疫力相關基因的表達規(guī)律，為以后改善該階段奶牛的免疫狀況提供理論基礎和科學依據。
　　

3、 主要研究結果如下:
　　 1奶牛圍產期血液學的研究
　　 通過對外周血中各種細胞數量以及血漿中GPT，GOT和GSH-Px酶的活性分析表明:白細胞總數在產前7天，14天顯著低于其它組(P＜0.05）;淋巴細胞從產前21天（3.34±0.13×109）/L逐漸降低至產后7天（2.41±0.13×109）/L，隨后又逐漸升高;相對于吞噬細胞和中性粒細胞在產犢期達到（1.45±0.02×109）/L和（3.12±0.26×

4、109）/L峰值，而嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞在產犢時卻僅為（0.13±0.06×109）/L和（0.05±0.03×109）/L，為7組中的最低值。
　　 從測定的結果可以看出，產前外周血紅細胞數量逐漸增加，產犢日達到峰值(6.04±1.02×1012)/L后逐漸降低，產前與產后差異顯著(p＜0.05)。血紅蛋白的含量在產前21天逐漸升高，產犢時達到最高水平，產后較低。血小板在產前21天逐漸增加，產犢后迅速降到最低值，之后逐漸

5、升高。
　　 血漿中酶活性分析表明，除GPT在圍產期差異不顯著（P＞0.05）外，GOT和GSH-Px兩種酶的活性在一定時期內存在顯著差異，特別是反映氧化應激的GSH-Px其產后第7天時達到峰值，極顯著高于其它組(P＜0.01)。
　　 2圍產期外周血T淋巴細胞亞群及細胞因子表達的研究
　　 通過應用流式細胞術測定CD3+、CD4+、CD8+及實時熒光定量(RT-PCR)檢測細胞因子IL-2，IL-4 mRNA表

6、達分析表明:血液中CD3+的比例在產前21天內占（50.8±4.61％），產后14天內降低到（33.3±3.53％），兩者差異極顯著（P＜0.01）;CD4+在產前21天內保持較高水平（21.38±0.65％），產后21天內維持在較低水平（6.89±0.32％），與產前差異極顯著(P＜0.01); CD8+的比例在產犢時達到最高水平（16.91±2.02％），差異顯著（P＜0.05）;而與機體免疫力直接相關的CD4+/CD8+的比值呈現

7、產前高而產后低的趨勢，產前CD4+/CD8+＞1，產后CD4+/CD8+＜1。IL-2 mRNA的表達量在產后0～14天內下調，之后上升。IL-4mRNA的表達量產犢期達到最高隨后下降，至第7天降至最低。
　　 3圍產期血液PMN中TLR-4途徑mRNA表達量的研究
　　 TLR-4途徑(TLR-4、CD14、MD-2)是調節(jié)PMN識別病原菌的主要通路。該通路上基因表達的趨勢直接反映機體的免疫狀態(tài)。本研究應用RT-PCR

8、分析了圍產期外周血PMN細胞中TLR-4途徑(TLR-4、CD14、MD-2)的mRNA表達，結果發(fā)現:PMN中TLR-4途徑基因(TLR-4，CD14，MD-2)中，TLR-4和CD14在產后14天內mRNA的表達量下調，而MD-2僅在產后7天下調。
　　 4圍產期TLR-4蛋白的表達量分析
　　 為進一步研究圍產期間TLR-4的變化，我們主要應用變性聚丙烯酰胺和Western Blot技術分別檢測了PMN中總蛋白和影

9、響PMN關鍵基因的TLR-4蛋白質的表達情況，研究發(fā)現:(1)血液PMN中總蛋白含量在不同階段差異不顯著（P＞0.05），可能與維持細胞活性的主要蛋白表達恒定有關，所表達的蛋白分子量在55～70 KDa之間占據表達優(yōu)勢。(2)產后14天內TLR-4蛋白表達顯著降低。
　　 通過以上研究我們可以得出以下結論:
　　 1奶牛圍產期階段外周血中白細胞數量（淋巴細胞、中性粒細胞、吞噬細胞等）及GOT、GSH-Px酶活性存在一定程

10、度的變化;
　　 2淋巴細胞的T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的數量和比例發(fā)生變化，尤其是產后CD4+/CD8+的比例較低，CD4+/CD8+＜1。
　　 3外周血中淋巴細胞中IL-2、IL-4的mRNA表達量發(fā)生改變。其中IL-2在產后14天內下調差異極顯著，IL-4在產后7天下調差異極顯著。
　　 4調節(jié)PMN紊亂的TLR-4途徑基因(TLR-4，CD14，MD-2) mRNA表達量在產后一定時間內下調