基于茶樹基因組測序信息的UGTs基因的分析、克隆與原核表達研究.pdf

1、茶樹中許多與品質(zhì)相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物是以糖苷形式存在的。UDPG依賴的糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)是催化糖苷形成的酶類。類黃酮合成途徑中存在一些相關(guān)的UGTs酶，促進黃酮醇、花青素、兒茶素和酚酸的糖苷化反應。研究這些基因及其功能，對茶樹良種選育、茶葉品質(zhì)調(diào)控具有重要意義。木實驗利用生物信息學手段、RACE技術(shù)、原核表達方法、RT-PCR技術(shù)，對茶樹中的UGTs基因進行分類、命名和克隆及表達分析。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.通過利用生物

2、信息學手段，從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中篩選UGTs基因。通過構(gòu)建進化樹，對茶樹68條CsUGTs基因進行分類，并依據(jù)擬南芥的分類方法，將茶樹68條CsUGTs分為12組。利用國際通行的系統(tǒng)命名法，分別對68條CsUGTs進行系統(tǒng)命名。
　　 2.利用同源克隆法，對CsUGT73E1、CsUGT78E1、CsUGT72F1進行cDNA克隆。3個基因編碼的氨基酸序列數(shù)分別為475、459和465；預測蛋白的分子量為53.72、49.48和

3、50.57kDa；等電點為5.62、5.96和5.71。信號肽分析表明3個基因均不含有信號肽。
　　 3.CsUGT78E1基因編碼的氨基酸序列與已知葡萄VvGT1(accessionnumber：P51094.2，PDBid：2c9z)最相似，一致性為59％，相似性為75％，符合同源建模條件。依據(jù)葡萄VvGT1的三維結(jié)構(gòu)，對CsUGT78E1進行同源建模，預測其合適的底物。同源建模預測CsUGT78E1可能以UDP-葡萄糖及花

4、青素、槲皮素和山奈素為底物形成3-O糖苷。
　　 4.利用構(gòu)建的pET32a-CsUGT73E1、pET32a-CsUGT78E1pET32a-CsUGT72F1、pGEX-4T-2-CsUGT73E1、pET28a-CsUGT78E1和pET28a-CsUGT72F1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達宿主菌BL21(DE3)，在0.1mmol/LIPTG濃度和不同溫度(37℃、25℃、16℃)誘導下進行原核表達，但是表達蛋白均以包涵體形式存在

5、。
　　 5.將pET32a-CsUGT78E1包涵體進行復性，并使用親和層析對復性后的蛋白進行純化，結(jié)果顯示經(jīng)過復性的pET32a-CsUGT78E1蛋白仍然無酶活性。
　　 6.通過實時熒光定量PCR技術(shù)，研究了CsUGT73E1、CsUGT78E1、CsUGT72F1在茶葉鮮葉不同發(fā)育階段和不同處理的表達變化。結(jié)果顯示，CsUGT73E1在芽中表達量最高，而CsUGT78E1和CsUGT72F1在成熟葉中表達量最高