豬瘟病毒E2基因乳腺特異表達載體的構建與細胞表達的研究.pdf

1、豬瘟是對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重的一種A類傳染病,其致病原是豬瘟病毒(CSFV).E2囊膜糖蛋白是CSFV的主要保護性抗原蛋白,應用真核細胞表達系統(tǒng)表達的E2蛋白免疫動物,對強毒的攻擊有較好的保護作用.利用乳腺生物反應器生產有經濟價值的生物活性蛋白已成為當前生物領域研究的熱點,制備乳腺生物反應器的關鍵環(huán)節(jié)是構建高效、特異的表達載體,而β-乳球蛋白(BLG)是反芻動物乳汁中特異的主要乳清蛋白.該研究以牛β-乳球蛋白基因上游調控成分作為啟動子,利用該

2、實驗室已有的豬瘟病毒E2基因,構建了E2基因的乳腺特異表達載體,并通過電穿孔方法轉染體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞,以驗證表達載體構建的合理性和E2蛋白的表達效率.并借助抗性基因Kana/neo(卡那霉素/新霉素抗性基因)和報告基因EGFP(增強型綠色熒光蛋白報告基因)來篩選、純化陽性克隆細胞,為利用核移植技術制作轉基因動物提供細胞來源,同時也為豬瘟基因工程疫苗的研究提供了一種手段.研究結果如下:利用PCR方法從奶牛血中克隆了牛β-乳球蛋白基

3、因上游調控成分(737bp),其中包括5'側翼序列(645bp)和第一外顯子中信號肽序列(92bp).PCR產物回收純化后,克隆在pMD 18-T載體的T位點.序列分析表明,該序列與Genbank中已有序列同源性均大于90%.DNA Star分析表明,此調控成分含有多種調節(jié)因子結合位點或反應元件,包括視黃酸反應元件(RARE)、佛波酯反應元件(TRE)、乳腺特異性因子(MSBF)和核因子1(NF1)結合位點等,這提示此調節(jié)元件可調控外源

4、基因在乳腺細胞中表達,可進一步用于構建乳腺特異表達載體.通過重組PCR方法,將克隆的牛BLG上游調控成分與豬瘟病毒E2基因連接起來,并克隆到pMD 18-T載體的T位點,形成pBE質粒.HindⅢ/Xba Ⅰ、Ase Ⅰ酶切pBE質粒,獲得BE片段.真核表達質粒pEGFP-C1在經Ase Ⅰ單酶切和5'端去磷酸化處理后,與BE片段經T4 DNA連接酶連接起來,構建了豬瘟病毒E2基因的乳腺特異表達載體.此載體含有報告基因EGFP(增強型綠