陸地棉花粉氮離子注入誘變效應及機理研究.pdf

1、離子束生物工程技術是一種新的生物技術,它通過離子束注入生物細胞,來研究其生物學效應和作用機理,用于誘變育種和基因工程等方面。1986年首次將離子束注入技術應用于誘變育種,通過離子束注入誘變,在多種植物、微生物中已獲得各種不同類型的突變體。但是,離子注入對細胞的作用機理尚不清楚,離子的穿透能力很弱,離子能否進入生物細胞及誘發(fā)基因發(fā)生突變仍然是有爭議的問題。本文主要研究氮離子束注入棉花花粉引起的生物學效應。 本研究采用能量為20ke

2、V的低能氮離子,分別以不同劑量(100單位(0.26×1016N+/Cm2、150單位(0.39×1016 N+/cm2)、200單位(0.52×1016 N+/cm2)、300單位(0.78 ×1016N+/cm2))的氮離子注入陸地棉(Gossypium hirsutum)品種蘇棉12號的成熟花粉,用處理花粉授粉,收獲種子。對處理花粉的活力、花粉表面結構、內部結構的變化、花粉萌發(fā)率、花粉管在花柱中的生長速度、受精情況等進行系統(tǒng)分析。

3、用SSR分子標記的方法檢測了離子注入花粉對于授粉后胚珠DNA變異的程度,用抑制性消減雜交法分析離子注入花粉授粉后代的基因表達差異。并分析離子注入花粉授粉后的農藝形狀變異。主要結果如下。 用花粉原位萌發(fā)法、聯(lián)苯胺-甲萘酚染色法、花粉管快速萌發(fā)法、FDA法(熒光素二醋酸脂法)、TTC(2,3,5-氯代三苯基四氮唑)染色法、離體萌發(fā)法等6種方法分別測定對照花粉、抽真空處理花粉及N+注入后的棉花花粉活力。TTC染色法不能有效檢測自然花粉

4、及N+注入后的花粉的活力,測定結果均為0％。除了TTC染色法外,其它5種方法均能測定自然花粉的活力,測定結果均為98％左右.花粉管快速萌發(fā)法不能準確測定經抽真空處理后的花粉的活力。抽真空處理對花粉的活力無明顯影響。聯(lián)苯胺-甲萘酚染色法、花粉管快速萌發(fā)法、TTC染色法、離體萌發(fā)法等4種方法均不能用來準確測定N+注入后的棉花花粉活力。FDA熒光染色法測定的花粉活力結果穩(wěn)定,重復性好,與原位萌發(fā)法測定的結果一致,是快速測定經N+注入處理后的棉

5、花花粉活力的簡便方法。N+注入花粉后,隨著離子注入劑量的增加,花粉活力呈明顯下降趨勢。 通過熒光顯微鏡觀察棉花花粉活體原位萌發(fā)(柱頭上萌發(fā))和離體條件下的原位萌發(fā)狀況,建立準確的觀察花粉粒在柱頭上的萌發(fā)和花柱中花粉管的生長狀況的簡便的方法,并找出棉花花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)溫度。結果表明：花粉在原位和離體情況下的原位萌發(fā)時間是基本一致的。活體原位萌發(fā)在授粉1 h后極個別的花粉粒開始萌發(fā),4 h后柱頭上的花粉粒全部萌發(fā)。12 h后大量的

6、花粉管生長至花柱基部；離體原位萌發(fā)在授粉2 h后開始有花粉粒萌發(fā),13 h后大量的花粉管長至花柱基部。授粉后,活體原位萌發(fā)較原位萌發(fā)晚1h。此外,在花粉管生長的同時,花柱也在生長?；ǚ勖劝l(fā)的合適培養(yǎng)溫度為25～35℃。而在培養(yǎng)溫度為30℃時,花柱中花粉管數(shù)量最多。通過掃描電鏡、透射電鏡、原位萌發(fā)和石蠟切片等方法觀察了N+注入棉花花粉后產生的各種變化,初步研究了不同劑量的N+注入棉花花粉的誘變機理及誘競舌產生的一系列生物學效應.結果表明：

7、隨著離子注入劑量的增大,離子注入使表面結構破損的花粉粒的數(shù)量逐漸增加,離子注入對于花粉表面有明顯的刻蝕作用,可產生不同大小和深度的孔洞和裂縫；花粉粒內涵物的量逐漸減少,排列致密性降低；離子注入劑量越高,花粉粒內部出現(xiàn)的空隙越多,造粉質體的體積變大,數(shù)量也越多；離子注入會明顯降低花粉的萌發(fā)率；N+注入花粉授粉后,花柱中花粉管的數(shù)量明顯下降,注入劑量愈大,花柱中花粉管的數(shù)量愈少,對照花粉授粉后花粉管的數(shù)量為：320±42條,劑量為100單位

8、、150單位、200單位爭300單位的N離子注入花粉后,花粉管的數(shù)量分別為：145±19.8、114±12.7、94±11.4和51.3±11條。 離子注入不影響授粉后雌雄配子受精。不同處理的花粉管生長速度是一致的,授粉后13小時,花粉管都能生長至花柱基部。不同劑量處理的花粉粒萌發(fā)后的受精時間是一致的。N+注入花粉授粉后,對子房的生長有明顯的影響,子房重量和直徑都隨注入劑的增加而降低。劑量為100單位、200單位和300單位的N

9、+注入花粉授粉后,SSR分子標記結果表明,胚珠的DNA多態(tài)性發(fā)生一定程度的改變。劑量為300單位的N+注入花粉授粉后,SSH分析獲得1個與已知功能基因同源序列,與EST庫中的序列同源的4條EST序列。離子注入花粉授粉后成鈴率降低,對M1代農藝形狀也產生變異,但變異程度是隨機的,與離子注入劑量之間無一定的規(guī)律.本研究結果充分說明N+注入花粉,會通過刻蝕作用進入細胞使細胞結構發(fā)生改變,改變細胞內的遺傳物質,降低花粉的活力,降低子房的生長速度