適冷蛋白酶與中溫蛋白酶溫度適應的分子基礎及其在海洋生物蛋白資源高值化加工中的應用研究

1、山東大學博士學位論文適冷蛋白酶與中溫蛋白酶溫度適應的分子基礎及其在海洋生物蛋白資源高值化加工中的應用研究姓名：何海倫申請學位級別：博士專業(yè)：海洋生物學指導教師：張玉忠20050101山東大學博士學位論文摘 要第一部分、適冷蛋白酶和中溫蛋白酶溫度適應的分子基礎自l9 9 9 年以來，實驗室開展了對深海適冷微生物和適冷蛋自酶的研究工作。陳秀蘭等( 2 0 0 1 ) 從1 8 5 5 米深的海底淤泥中分離到產適冷蛋白酶的適冷菌P s e u

2、 d o a l t e r o m o n a s s p ．S M 9 9 1 3 ，分離純化了該菌分泌的具有典型適冷特征的適冷蛋白酶M C P - - 0 1 ，對并對其酶學特性進行了系統(tǒng)的研究，研究表明M C P ．0 1 為適冷絲氫酸蛋白酶( C h e n e ta 1 ．2 0 0 2 ，C h e ne ta l ，2 0 0 3 a ；C h e n e ta l ，2 0 0 3 b ) 。在此研究基礎上，以屬于同一

3、家族的中溫蛋白酶B P ．0 1 為參照，對M C P 一0 l 結構與功能的關系進行了系統(tǒng)的研究，揭示了M C P ．0 1 高效適冷催化、穩(wěn)定性差、對熱敏感的分子結構基礎。首先克隆了B P —0 1 的基因，根據(jù)基因的堿基序列推導出B P ．0 1 的氨基酸序列，與潘軍( 2 0 0 5 ) 推導的M C P ．0 1 的氨基酸序列進行比對，結果表明M C P ．0 l和B P ．0 1 的氨基酸序列同源性較低。通過同源模建，分別構

4、建了M C P ．0 1 和B P ．0 l的三維結構。M C P ．0 1 和B P —O l 的催化結構域都屬于s u b t i l a s e ．s 8 類型，二者的活性中心的構象相似，由a 螺旋和p 折疊組成了酶的催化腔，參與催化反應的三個氨基酸錢基A s p ，S e r 和H i s 都位于催化腔內，表明M C P ．0 1 和B P —O l 的催化機制相同。與B P —0 1 相比，M C P ．0 1 分子中a 螺旋

5、較少．而D 轉角和無軌卷曲較多，使得分子柔性增強，更易變構．C D 光譜檢測也證實了這一點。M C P ．O i 和B P ．0 1的變構溫度分別為4 9 ．5 ℃和6 0 ．2 ℃，表明M C P 一0 1 更易變構。絲氨酸蛋白酶抑制劑P M S F 能夠完全抑制M C P ．0 1 和B P ．0 1 的活性，但C D光譜和熒光光譜表明，P M S F 對兩者的構象沒有影響。由于M C P ．0 1 活性中心有c a ”存在，E D

6、 T A 對M C P 一0 1 構象和活性影響較大，a 螺旋減少明顯減少，而對B P ．0 1 的活性和構象沒有影響，推測M C P ．叭的柔性構象需要C a 2 + 維持其穩(wěn)定。鹽酸胍通過爭奪蛋白質分子中結合的水分子而引起蛋白構象的改變。鹽酸胍使兩種蛋白酶的熒光發(fā)射峰降低，且發(fā)生紅移，M C P ．0 1 紅移較大，近2 0 h m ，說明M C P - 0 1 和B P ·0 1 分子中T y r 和T r p 的位置及