中國近海典型赤潮生物種間及生理指示生物標志物研究.pdf

1、東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)和鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catenella)是我國近海兩種主要有害赤潮生物，在東南沿海常形成大規(guī)模的赤潮，已對近海生態(tài)系統(tǒng)、沿海養(yǎng)殖業(yè)、人民健康和生命財產安全構成了嚴重威脅。 本論文以這兩種赤潮生物為模式種，引入現代蛋白質組學概念及技術，比較了四種蛋白質提取方法，建立了用于赤潮生物蛋白質組學研究的總蛋白質提取方法：研究了兩種亞歷山大藻蛋白質組

2、的差異，確認了種間特異性指示蛋白；比較研究了不同生長期和生長條件下，赤潮生物蛋白質組的差異表達，確認、鑒定了一批特異性生理指示生物標志物，探討了它們在赤潮生物生命活動及赤潮形成中的作用。取得的主要結果如下： 1．建立和優(yōu)化了用于赤潮生物蛋白質組學研究的總蛋白提取方法。比較研究了四種蛋白質提取方法：曲拉通100—尿素提取法、三氯乙酸—丙酮沉淀法、40mMTris—5％甘油提取法和40mMTris提取法的蛋白提取效果。結果表明，曲

3、拉通100—尿素提取法的蛋白提取效果最好，蛋白點分離清晰，蛋白點數多(可達上千點)，而且未造成堿性蛋白和高分子量蛋白的丟失。該方法提取過程簡單，操作簡便，為開展赤潮藻生物蛋白質組學研究提供了一種高效、簡便的方法； 2．結合形態(tài)分類學和分子生物學方法，比較研究了我國近海兩種主要赤潮生物塔瑪亞歷山大藻A．tamarense DH01和鏈狀亞歷山大藻A．catenella DH01蛋白質組的差異表達，發(fā)現它們的蛋白2—DE圖譜相似性

4、達99％，在分類上，這兩種亞歷山大藻應屬于同一種藻。同時也發(fā)現了一些特異性表達蛋白，如A．tamarense DH01中的AT1—5，A．catenella DH01中的AC1—3，它們可作為種內鑒定的一類特異性生物標志物； 3．比較研究了不同生長時期東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻蛋白質組的差異表達，發(fā)現了一些與細胞生長周期相關的生物標志物：在東海原甲藻中發(fā)現了一個與細胞周期調控相關的cdc2蛋白激酶1，該蛋白在指數生長期的藻細胞

5、中表達明顯，在消亡期表達量明顯下降，一些蛋白，如17—19號(RubisCo)，21、23-26、28、30號，在消亡期幾乎不表達；在鏈狀亞歷山大藻種也發(fā)現了多個蛋白，31—35，46—48、61—70號蛋白在消亡期表達量明顯下降。這些蛋白可作為指示細胞不同生長期的一類潛在的特異性生物標志物； 4．比較不同營養(yǎng)狀態(tài)下的細胞蛋白質組的差異表達發(fā)現，在氮或磷限制的條件下，東海原甲藻細胞中的一些蛋白，如PC1、PC3、PC5和PC7

6、—9不表達，而一組酸性蛋白，PC2表達明顯增加，這些蛋白可作為指示氮或磷限制的生物標志物；而一些蛋白僅在氮限制時表達明顯減弱(PC4、PC6)或不表達(PP1—3)，這些蛋白可作為指示氮限制的生物標志物：在鏈狀亞歷山大藻中也發(fā)現了一個與氮限制相關的蛋白AN1：一些蛋白，如AN1—5、AP1和AC1在添加氮或磷后表達明顯增強，并在藻細胞處于良好生長狀態(tài)時也有很強的表達，這些蛋白可作為指示藻細胞處于良好營養(yǎng)狀態(tài)的生物標志物； 5．