鳀魚蛋白酶解多肽高附加值開發(fā)利用研究.pdf

1、硫酯酶結構域（Thioesterase，TE）在催化線性多肽環(huán)化時具有區(qū)域定向性、化學定向性和立體定向性的特點。結合成熟的線性多肽化學合成法和晶體結構解析，對其底物適用性做了進一步研究，并嘗試作用于海洋蛋白水解多肽，希望為以海洋生物活性線性肽環(huán)化為基礎的新型海洋環(huán)肽藥物修飾與開發(fā)提供一條全新的研究思路。
　　我們從前期得到的McyC TE(Microcystin thioesterase，McyC TE)，為進一步提高該酶的表達量

2、，深入研究該酶催化底物的適用性，本研究利用單因素和正交試驗得到最佳誘導表達條件為：誘導時機2h，誘導劑濃度0.75mmol/L，誘導時間6h，誘導轉速210rpm，誘導溫度20℃，使 TE的表達量由3.5mg/400mL提高至8.86mg/400mL。McyC TE獲得穩(wěn)定大量表達。
　　基于前期 cilengitide及其類似物的研究，我們設計了5肽到10肽不同長度的6條肽，進行底物適用性研究。結果表明，McyC TE并不遵循“

3、4n+2/4n原則”，也無肽鏈氨基酸奇偶性的選擇。底物中轉角過多不僅不利于環(huán)肽的形成，更可能形成卷曲影響環(huán)化。環(huán)化產物的出現表示無 D型氨基酸亦可通過加入其它位阻較小較靈活或者自帶天然轉角的氨基酸弱化肽鏈的剛性，比如 Gly、Pro，使天然產物藥物篩選范圍增大，也為增強天然多肽藥物藥效增加了改良方案。含苯環(huán)的Phe的引入在一定程度上增加了環(huán)化率，可見疏水性氨基酸的加入利于環(huán)化。本次研究更證明了延長多肽鏈長度也可環(huán)化，McyC TE的底物

4、容忍度較大。這些結論既補充了本課題組的前期研究，也為進一步研究McyC TE的催化功能提供了實驗基礎。
　　高純度是McyC TE結晶的先決條件。經3次純化和結晶條件的篩選優(yōu)化后，在0.1M HEPES pH7.2，1.5M LiSO4條件下得到分辨率為2.84的單晶，參數為 a=150.748，b=150.748，c=97.516。并將其結構與已解析結構的Srf TE進行比對，發(fā)現McyC TE結構多出2段序列23-36 YAQ

5、......RPY和154-181 DAF......TYH，這2段序列位于其蓋子區(qū)域。比對結果中，McyC TE與1JKM/2VSQ中催化三元件（His133/Asp236/Ser106）對應各氨基酸的空間位置一致。底物的存在只起到促進蛋白結晶，縮短結晶時間的作用。借鑒 Srf TE的研究，可以選取已知可以環(huán)化或水解的底物進行修飾改造，使其可以被 TE?；?，但是不能發(fā)生隨后的去?；磻?，利于得到酶與底物相結合的晶體，進行 McyC