大腸桿菌Nissle1917染色體—質粒平衡致死系統(tǒng)的構建及功能研究.pdf

1、近年，有關細菌靶向治療腫瘤的研究取得了巨大進展，但大量的研究工作主要集中在利用活菌本身或其產物使腫瘤局部破壞或引發(fā)機體免疫反應來達到控制、治療腫瘤的目的，因其缺乏特異性和針對性，且毒副作用大，難以推廣應用和臨床研究。非致病性大腸桿菌Nissle1917(O6∶K5∶H1)作為一種益生元在歐洲已經獲得治療腸病的認證長達九十余年，大量的試驗、臨床依據表明，這種細菌藥物是有效和安全的。有研究表明大腸桿菌Nissle1917對血清敏感，對實體瘤

2、具有偏好性且可在實體瘤內大量增殖，鑒于這一特性，人們嘗試以其為宿主菌構建可表達外源基因藥物的工程菌來特異性的治療癌癥。但大腸桿菌等宿主菌中重組質粒的選擇和維持大多依賴于抗生素及抗生素抗性基因，在工業(yè)、醫(yī)療和食品行業(yè)應用中存在生物安全的風險，因此國際生物技術研究和管理部門致力于新型非抗生素選擇標記方法的研究。目前，能替代抗生素抗性標記的主要有營養(yǎng)缺陷型標記，即所謂的染色體--質粒平衡致死系統(tǒng)，原理是構建宿主菌的營養(yǎng)缺陷突變子，再將缺陷基因

3、的正常拷貝構建于質粒載體，通過質粒與宿主菌染色體之間的基因互補達到穩(wěn)定重組質粒的目的。
　　 基于以上考慮，本研究利用高效、便利的Red/ET同源重組和位點特異性重組技術對大腸桿菌Nissle1917谷氨酰胺合成酶基因(glnA)進行敲除，獲得大腸桿菌Nissle1917谷氨酰胺營養(yǎng)缺陷株。再克隆全長的glnA基因，以誘導型表達質粒pGB-Ptet-Amp為基礎，采用同源重組替換該質粒載體上的氨芐青霉素(Amp)抗性基因，獲得無

4、抗性篩選標記基因的互補質粒pGB-Ptet-glnA，通過電擊轉化大腸桿菌Nissle1917 glnA基因缺失突變株，建立起無抗性標記的染色體--質粒平衡致死系統(tǒng)。
　　 為深入研究大腸桿菌Nissle1917染色體--質粒平衡致死系統(tǒng)的功能，從惡臭假單胞菌Pseudomonas putida KT2440中擴增編碼抗癌肽的azurin基因并在N端融合胡蘿卜軟腐歐文氏菌果膠酶pelB基因信號肽序列，克隆入平衡致死系統(tǒng)的互補表達