大口黑鱸Myf5基因結構分析和對魚類肌肉生長作用的研究.pdf

1、主要研究內(nèi)容如下： 1.利用RT-PCR和RACE技術克隆了大口黑鱸Myf5 cDNA序列1093bp，其中開放閱讀框長723bp,編碼240個氨基酸，3’非翻譯區(qū)長370bp，存在轉錄終止序列ATTAAA。經(jīng)分析該蛋白無信號肽序列，屬核蛋白，含有一典型的堿性螺旋一環(huán)一螺旋結構域。大口黑鱸Myf5基因氨基酸序列與14種脊椎動物相比同源性介于56％-93％之間。其中bHLH結構域與其他魚類相比同源性可達到90％以上，與人、鼠、牛、

2、雞、非洲爪蟾相比也有82％以上的同源性，在不同的物種中呈現(xiàn)出較高的保守性，序列高度的保守性與其重要的生物學功能有關。 2.應用高保真PCR技術，設計特異引物分離得到該基因基因組序列，再與已獲得的ORF序列進行比對，確認外顯子與內(nèi)含子邊界。該基因共存在三個外顯子與兩個內(nèi)含子，外顯子1、2、3分別長453bp，73bp和197bp。內(nèi)含子1，2分別長920bp和328bp，內(nèi)含子與外顯子邊界均符合GT-AG規(guī)則。通過大口黑鱸、條紋

3、鱸、褐牙鲆和斑馬魚的基因組序列比對，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1中存在123bp魚類中同源性為86％的保守序列，推測它可能在對Myf5基因的時空和組織特異性表達過程中起到調(diào)節(jié)作用。 3.應用基因組步移(Genome Walker)技術，根據(jù)外顯子1序列設計引物，分離得到啟動調(diào)控區(qū)2690bp。應用生物信息學軟件預測存在基礎轉錄調(diào)控元件TATA框、GC框、CCAAT框(核轉錄因子NFY能對該序列進行調(diào)控)和八聚體轉錄因子1(Otc-1)結合位

4、點。存在與肌肉特異性轉錄調(diào)控相關的元件有E-box 18個、肌細胞特異增強因子2(Myocyte specific enhancer factor2，MEF2)結合位點3個、上游激活因子(Upstream stimulating factor，USF)結合位點2個、血清應答因子(Serum response factor，SRF)結合位點2個、核轉錄因子sp1結合位點8個、肌肉特異性金屬硫蛋白MTBF(Muscle-specific M

5、t binding site factor)結合位點3個。與早期誘導肌肉分化信號有關的調(diào)控元件有早期生長應答因子α(Early growth response gene α，EGRα/TIEG)結合位點、早期快反應生長應答因子1(Early growth response gene 1，Egr-1/Krox-24)結合位點、早期快反應生長應答因子2(Early growth response gene 2，Egr-2/Krox-20)結

6、合位點、生長依賴因子l(Growth factor independence 1)結合位點、T細胞因子TCF/LEF-1結合位點，這些轉錄因子可能是調(diào)控Myf5基因在體節(jié)形成期早期表達的主要因子。 4.將Myf5基因的ORF定向克隆至pcDNA3.1(-)/mycHisB載體，構建真核重組表達載體pcDNA3.1(-)/mycHisB-Myf5，溶于生理鹽水，肌肉注射法注入羅非魚右側背部肌肉作為實驗組，左側背部肌肉注射pcDNA

7、3.1(-)/mycHisB質粒作為對照組，RT-PCR和免疫組化實驗證實外源Myf5:mycHis基因已在肌肉組織中局部表達，對照組肌肉組織無外源基因表達。 5.肌注60天后，應用石蠟組織切片技術對實驗組與對照組注射部位肌肉組織塊進行比較觀察，發(fā)現(xiàn)實驗組白肌肌纖維直徑較對照組有顯著變化，實驗組白肌肌纖維直徑平均增大9％，單位面積上肌纖維數(shù)量減少，然而紅肌的肌纖維密度與直徑并無顯著變化，是否紅肌中的肌肉前體細胞存在不同的信號調(diào)控