潛在影響溶腫瘤腺病毒功能的腫瘤細胞內在基因Darpp-32和PRSS3的功能鑒定及其作用機制.pdf

1、鑒于中晚期惡性腫瘤常規(guī)治療療效有限而且副作用明顯,用復制選擇性溶腫瘤病毒進行癌癥靶向治療近來已引起人們廣泛的關注。2005年,刪除E1855K基因的5型腺病毒H101獲得中國國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準上市,與化療結合用于人頭頸部惡性腫瘤的臨床治療,成為世界上第一個由官方機構正式批準的復制選擇性溶腫瘤病毒藥物。該病毒與常規(guī)放化療相結合顯示出非常令人鼓舞的效果,但是作為單一制劑卻療效甚微。因此,從臨床實踐上急需研究哪些因素影響溶

2、腫瘤腺病毒的潛能,從而為提高其療效尋找新的策略。
　　 溶腫瘤腺病毒抗腫瘤效果取決于腫瘤細胞、病毒和機體對病毒免疫反應之間的相互作用。腫瘤發(fā)生過程中細胞內基因的變化可以導致細胞表面黏附分子和細胞內信號傳導通路的改變,從而影響腺病毒感染腫瘤細胞的能力以及病毒在腫瘤細胞中的復制能力。不同組織來源、不同類型的腫瘤細胞對復制選擇性溶腫瘤腺病毒(replication-selective oncolytic adenovirus,RSOA

3、)的敏感性差異顯著,充分說明腫瘤細胞內在基因的變化對RSOA的潛能有重要影響,目前該方面的研究國內外鮮見報道。通過對一系列腫瘤細胞對腺病毒敏感性的篩選,我們先前發(fā)現(xiàn)了一個很好的細胞模型:PaTu8988s和PaTu8988t。這一對細胞來自同一個腫瘤病人,對腺病毒的敏感性卻差異顯著。為了進一步發(fā)現(xiàn)哪些腫瘤細胞內在基因影響腫瘤細胞對腺病毒的敏感性,我們利用Affymetrix array高通量篩選技術對腺病毒非常不敏感的PaTu8988s

4、和對腺病毒非常敏感的PaTu8988t兩株細胞基因表達圖譜進行了比較,結果發(fā)現(xiàn)Darpp-32和PRSS3是兩個潛在的可能影響腺病毒潛能、且尚未報道的候選基因。為了研究這兩個基因與腫瘤細胞對溶腫瘤腺病毒敏感性的關系,本課題從高表達候選基因及關閉候選基因兩方面對其進行功能鑒定,并進一步研究其作用的分子機制。該研究結果為設計增強RSOA殺傷腫瘤細胞能力的新方法提供了科學理論依據(jù)和方向。本研究分以下兩個部分。
　　 第一部分 t-Da

5、rpp多磷酸化位點相互作用調控腫瘤細胞對腺病毒的敏感性
　　 Darpp-32(dopamine and cAMP regulated phosphoprotein32)是多巴胺和cAMP活化調節(jié)的磷酸化蛋白。該基因影響多種生理過程,在神經(jīng)遞質受體、離子通道、離子泵以及細胞核內轉錄因子等眾多磷酸蛋白的磷酸化、生理活性以及耐藥等多方面發(fā)揮著關鍵的控制作用。近來發(fā)現(xiàn)該基因亦與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤細胞對一些抗腫瘤制劑的反應有密

6、切的關系。但未見任何關于Darpp-32與病毒感染之間關系的報道。
　　 從表型上看,Darpp-32在腫瘤中的表達與腫瘤細胞對腺病毒的敏感性呈負相關。進一步研究發(fā)現(xiàn),在一系列人胰腺癌及結直腸癌細胞系中表達的是Darpp-32的剪切同位體t-Darpp。通過關閉t-Darpp和高表達t-Darpp兩條途徑進行功能性鑒定,我們首次發(fā)現(xiàn),在不同的細胞系中,t-Darpp分別呈現(xiàn)出增強、減弱或者不影響腫瘤細胞對溶腫瘤腺病毒的敏感性三種

7、不同的功能。鑒于Darpp-32基因中存在多個磷酸化位點,并且不同位點磷酸化在功能上相互調控從而影響其功能。我們推測,t-Darpp的磷酸化狀態(tài)可能是該基因在不同細胞系中呈現(xiàn)不同功能的原因。為了證實我們的假說,通過免疫沉淀的方法收集不同細胞系中產(chǎn)生不同作用的t-Darpp純化蛋白,用質譜檢測它們的磷酸化位點。結果不僅證實了我們的假說:t-Darpp在對腺病毒敏感性不同的腫瘤細胞中存在不同的磷酸化位點,更為重要的是我們發(fā)現(xiàn)了一個尚未報道的

8、、新的t-Darpp磷酸化位點。進一步功能實驗證實,這些磷酸化位點的相互作用調控著腫瘤細胞對腺病毒的敏感性。此外,我們對t-Darpp如何影響腺病毒的生命周期的分子作用機制進行逐步研究,發(fā)現(xiàn)t-Darpp影響腺病毒在腫瘤細胞上的吸附進而影響腺病毒入核、DNA復制等細胞內的后續(xù)過程。本研究結果提示,t-Darpp多磷酸化位點相互作用調控腫瘤細胞對腺病毒的敏感性；特殊位點磷酸化的t-Darpp可能是預測腫瘤細胞對腺病毒基因治療敏感性的生物標

9、記物,有望成為提高腺病毒抗腫瘤效果新的治療靶向。更為重要的是,t—Darpp新磷酸化位點的發(fā)現(xiàn)提示該基因可能具有其它未知的生物學功能。
　　 第二部分 PRSS3不影響腫瘤細胞對腺病毒的敏感性,但促進胰腺癌細胞的生長和轉移
　　 PRSS3是胰蛋白酶原家族的一員,多數(shù)文獻報道該基因與細胞癌變有關。從PRSS3蛋白表達的表型上看,該基因與腫瘤細胞對溶腫瘤腺病毒的敏感性相關,但是功能鑒定結果顯示PRSS3并不影響腺病毒對腫瘤

10、細胞的殺傷能力。然而在功能性鑒定PRSS3對腺病毒感染性影響的實驗中,我們觀察到穩(wěn)定表達PRSS3的PuTa8988t細胞體外培養(yǎng)生長速度明顯比空載體轉染的細胞快。由于PaTu8988t和PaTu8988s源自同一個胰腺癌患者,轉移能力卻差異顯著,我們推測PRSS3可能影響腫瘤細胞生長和轉移。
　　 本研究通過qPCR和Western Blotting檢測一組人胰腺癌細胞系中PRSS3的表達；通過高表達外源性PRSS3基因觀察該

11、基因對癌細胞體外增殖、腫瘤生長和體內轉移的影響；通過ELISA檢測細胞VEGF的表達及PRSS3調控VEGF表達的信號傳導通路；通過動物實驗檢測抑制該轉移通路的體內治療效果；最后,通過免疫組化檢測PRSS3蛋白在人胰腺癌組織中的表達。結果發(fā)現(xiàn),PRSS3在轉移的PaTu8988s細胞中高表達,而在不轉移的PaTu8988t細胞中不表達。進一步研究顯示PRSS3通過PAR-1介導ERK磷酸化導致VEGF在腫瘤細胞中高表達,從而促進腫瘤細胞

12、的生長和轉移。MEK1／2抑制劑可以顯著延緩轉移的進程、延長荷瘤實驗動物的生存時間(P<0.05)。最后,我們分析了PRSS3在人胰腺癌組織中的表達與臨床病理因素之間的關系。結果和預期一樣,PRSS3在正常胰腺腺泡細胞中表達,在正常導管上皮細胞中不表達,而在胰腺導管上皮細胞癌組織中表達。在74例胰腺導管上皮細胞癌組織中,30例(40.5％)PRSS3呈陽性表達,44例(59.5％)呈陰性表達。更有意義的是,PRSS3在浸潤至血管內和淋巴