CD88在肝癌侵襲轉移中的作用及其機制.pdf

1、肝癌是國內常見的惡性腫瘤之一，其侵襲轉移與復發(fā)是患者死亡的主要原因之一。因此，探索肝癌侵襲轉移與復發(fā)的發(fā)生機制，尋求有效的抗肝癌轉移與復發(fā)治療措施，對改善肝癌患者的預后具有重要意義。
　　研究依據(jù)：CD88又稱補體5片段受體(complement component5a receptor，C5aR)，是一種在細胞膜表面的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，其在體內主要分布在髓來源細胞系，參與一系列炎癥反應過程，如趨化作用，促進多種細胞的釋

2、放反應(如前列腺素、5-HT、組胺、IL-1、IL-6等)，增加血管通透性等。近來研究發(fā)現(xiàn)CD88在肝臟再生實質細胞中表達，并且在肝損傷后的肝細胞再生修復過程中發(fā)揮重要作用。CD88還參與了細胞抗失巢凋亡、新生血管生成等。CD88與其配體C5a結合后可激活下游的G蛋白、WASP、β-arresting等信號分子，引起P13K/AKT、Ras/Raf/MEK/ERK和c-Src/JAK等信號通路反應，可激活CREB、NF-κB、STAT3

3、等核轉錄因子。近來研究發(fā)現(xiàn)CD88在乳腺癌、肺癌、腦膠質細胞瘤組織中表達較正常組織明顯升高。Markiewski等報道在小鼠子宮頸癌模型中，通過補體5敲除或CD88拮抗劑應用后小鼠子宮頸癌腫瘤的增殖明顯受到抑制，其機制可能與微環(huán)境中髓來源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)增加并抑制腫瘤微環(huán)境中CD8+T細胞的數(shù)量和功能。在我所前期實驗中發(fā)現(xiàn)Micro-RNA26表達較低的肝癌患者預后較

4、高表達的患者預后差，通過對兩者基因芯片掃描結果顯示低表達Micro-RNA26的癌組織較高表達Micro-RNA26的癌組織中CD88表達明顯升高，這提示低表達Micro-RNA26可能通過上調CD88表達的同時上調IL-6、NF-κB促進腫瘤發(fā)展。
　　但迄今為止，它對肝癌的影響尚未有明確報道。本實驗首先在肝癌、相應癌旁組織以及不同轉移潛能肝癌細胞系中檢測CD88表達差異；研究其與肝癌發(fā)生、發(fā)展以及預后的相關性；通過轉染與干擾調

5、節(jié)CD88表達后，探討CD88與肝癌細胞侵襲與轉移的關系。
　　第一部分 CD88在肝癌組織及肝癌細胞系中的表達研究
　　目的：研究CD88在肝癌細胞株及肝癌、相應癌旁組織中的表達差異，初步分析其與肝癌發(fā)生的關系。
　　方法：應用熒光定量PCR、免疫組織化學及Western Blot方法檢測CD88在56例肝癌、相應癌旁組織中的表達。應用熒光定量PCR、Western Blot及免疫熒光檢測不同轉移潛能肝癌細胞的CD8

6、8表達情況。
　　結果：熒光定量PCR顯示CD88在肝癌、相應癌旁中的相對表達量分別為0.056±0.014 vs.0.003±0.0004，肝癌與癌旁兩者間差異明顯(p<0.001)。Western Blot結果同樣顯示肝癌組織CD88表達高于癌旁組織(3.71±0.92 vs.0.91±0.34，p<0.01)；在肝癌組織中早期復發(fā)組CD88表達要明顯高于非早期復發(fā)組(4.43±0.48 vs.1.64±0.28，p<0.05

7、)。免疫組織化學顯示兩者都有CD88表達，但肝癌組織中的表達明顯高于后者　　結論：CD88在肝癌發(fā)生發(fā)展中可能有重要作用。
　　第二部分CD88表達與肝癌臨床病理特征及相關性研究
　　目的：研究CD88在原發(fā)性肝癌中的表達情況，探討CD88在肝癌組織中表達的相關

8、性、與原發(fā)性肝癌的關系及臨床生物學意義。
　　方法：組織芯片檢測403例肝癌組織中CD88的表達，統(tǒng)計分析其與肝癌臨床病理特征及預后的關系。
　　結果：CD88蛋白的過表達與肝癌患者的血漿高AFP水平、腫瘤直徑大于5cm、有肉眼癌栓、高BCLA臨床分期和高CLIP分期等臨床病理因素有明顯關聯(lián)(p<0.05)。CD88表達陽性組的7年總體生存率及無病生存率明顯低于CD88陰性組(p<0.05)，分層Kaplan-Meier分析

9、顯示在高AFP組、單個腫瘤組、高腫瘤分化組、無微血管侵犯組中肝癌組織中CD88過表達患者OS和DFS均較低表達組差。多因素分析表明血清GGT>54U/L、血清AFP>20ng/ml、有肝硬化、腫瘤直徑>5cm、多個腫瘤、有微血管癌栓及CD88表達陽性是影響OS的獨立預后因素；血清GGT>54U/L、血清AFP>20ng/ml、有肝硬化、多個腫瘤、有微血管癌栓及CD88表達陽性等為DFS的獨立預后因素。
　　結論：CD88與原發(fā)性肝

10、癌的侵襲、轉移及不良預后相關。
　　第三部分調節(jié)CD88表達對肝癌細胞侵襲與轉移的影響
　　目的：研究CD88與肝癌細胞侵襲與轉移的關系。
　　方法：轉染pReceiver-M55-CD88 cDNA和GPHI/GFP/Neo-CD88-shRNA，篩選出穩(wěn)定細胞株，經(jīng)western blot，qRT-PCR驗證CD88表達改變后，C5a刺激試驗研究基質金屬蛋白酶(MMP2、9)及血管內皮生長因子(VEGF)mRNA變

11、化；MTT檢測CD88表達改變后，細胞增殖能力變化；Transwell研究細胞遷移侵襲能力變化。細胞接種于裸鼠肝原位，研究CD88改變后，細胞成瘤與肺轉移能力的改變：免疫組化檢測移植瘤的CD88、MMP9和VEGF表達。
　　結果：轉染pReceiver-M55-CD88 cDNA和GPHI/GFP/Neo-CD88-shRNA于低轉移能力的HepG2與高轉移的HCCLM3，G418篩選出穩(wěn)定細胞株，Western blot和qR

12、T-PCR驗證CD88表達明顯上調或下調；Transwell實驗結果顯示上調或下調CD88表達后的肝癌細胞的遷移和侵襲能力明顯增加或減少；rC5a刺激后細胞mRNA研究顯示CD88的表達與MMP2，MMP9，VEGF的分泌呈正相關。CD88表達水平對肝癌細胞增殖有一定影響。高表達CD88的肝癌細胞體內成瘤能力較低表達肝癌細胞明顯上升，高CD88表達組細胞的肺轉移灶明顯增加，且以Ⅲ、Ⅳ期為主；下調HCCLM3的CD88后較對照組MMP9和