鈉氫交換蛋白-1在肝癌細胞MHCC97-H侵襲轉移中的作用及其機制的研究.pdf

1、肝癌是世界范圍內第五大最常見惡性腫瘤，也是我國最常見的惡性腫瘤之一，是我國的第二癌癥殺手。由于早期診斷和治療難度大，腫瘤惡性程度高，預后往往不理想，給大眾健康造成了極大的威脅。雖然以手術切除為主的綜合治療近年來取得了很大的進步，但許多成功接受手術切除并且術后聯(lián)合多種輔助治療的患者，其預后仍然不佳。其原因是多方面的，但主要還是腫瘤的早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)時多已屬晚期，治療難度大，且術后腫瘤容易出現(xiàn)復發(fā)和轉移。根據(jù)相關研究，多數(shù)肝癌患者主要死于

2、轉移相關的一些并發(fā)癥。因此，研究肝癌侵襲轉移各個環(huán)節(jié)中相關的分子調控機制，并針對其中的環(huán)節(jié)制定相應的治療措施具有十分重要的臨床意義。
　　鈉氫交換蛋白-1(Na+/H+exchanger 1，NHE1)是表達于細胞膜表面的離子交換蛋白，其主要功能是調節(jié)細胞內外的pH值，并且可以通過肌動蛋白結合蛋白錨定肌動蛋白，發(fā)揮調節(jié)細胞骨架的功能。在許多腫瘤中都有NHE1的過表達或活性增強，并認為其參與了腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化、侵襲和轉移等

3、多個過程。但是，鈉氫交換蛋白-1在肝癌細胞中發(fā)揮著怎樣的作用目前還不明確。
　　目的：
　　本實驗通過設計合成的特異性NHE1-siRNA為實驗手段，研究NHE1在肝癌細胞系MHCC97-H侵襲轉移中的作用及其相關機制。
　　方法：
　　首先設計合成3條針對NHE1基因的特異性小干擾RNA(small inter-fering RNA，siRNA)，采用脂質體轉染MHCC97-H肝癌細胞系，通過realtime

4、PCR和Western blot的方法檢測轉染后各組細胞NHE1 mRNA和蛋白表達水平的變化，并檢測轉染后各組細胞內外pH值變化。選擇一條抑制效率最高的NHE1-siRNA用于后續(xù)實驗。然后用特異性NHE1-siRNA轉染細胞，通過免疫熒光染色、掃描電鏡、western blot、明膠酶譜、侵襲和遷移等實驗方法檢測轉染后各組細胞相關指標的變化。
　　結果：
　　1、將針對NHE1基因的siRNA成功轉入肝癌細胞MHCC97

5、-H后，realtimePCR、Western blot及細胞內外pH值檢測結果顯示，序列為（正義鏈：5′-GCCCUGUUAAUCAUUCCGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGGAAUGAUUAACAGGGCTT-3′）的NHE1-siRNA抑制效率最高。將其作為后續(xù)實驗用特異性siRNA。
　　2、應用特異性NHE1-siRNA抑制肝癌細胞NHE1后，熒光顯微鏡和掃描電鏡結果顯示，NHE1-siRNA組MHCC97-H細胞發(fā)生

6、回縮，極性減弱，細胞內肌動蛋白網(wǎng)排列紊亂，形成減少，細胞表面?zhèn)巫慊乜s，形成減少或消失。遷移實驗結果提示，轉染特異性NHE1-siRNA后，細胞遷移能力減弱。
　　3、應用特異性小干擾RNA抑制肝癌細胞NHE1后，侵襲實驗顯示，NHE1-siRNA組MHCC97-H細胞穿透小室基底膜的細胞數(shù)目明顯減少。western blot和明膠酶譜實驗發(fā)現(xiàn)轉染NHE1-siRNA組細胞MMP-2和MMP-9表達和活性均降低。推測NHE1可能通過